王麗輝

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

雞傳染性支氣管炎病是由冠狀病毒科冠狀病毒屬雞傳染性支氣管病毒（IBV）感染引起的，主要通過呼吸道感染[1-2]。其潛伏期短、發(fā)病快，多發(fā)于雛雞，雛雞感染會繼發(fā)引起其他病菌感染，以呼吸道癥狀和生產(chǎn)性能下降為主要特征，臨床上多表現(xiàn)為呼吸困難、假母雞、腎炎及產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降[3-5]。

雛雞感染癥狀多以呼吸道癥狀為主，產(chǎn)蛋雞感染此病，以產(chǎn)蛋率下降、蛋殼和蛋品質(zhì)下降為主，給養(yǎng)殖戶帶來的損失更大[6-7]。

試驗(yàn)針對重慶某雞場的部分發(fā)病雞，經(jīng)臨床診斷和對病死雞的剖檢初步診斷為雞傳染性支氣管炎病，并對病死雞的氣管和腎臟的病料進(jìn)行RTPCR診斷，確診為雞傳染性支氣管炎。我國此前就有雞傳染性支氣管炎病的報道，其在不同地區(qū)均有發(fā)生，并且雞傳染性支氣管炎病毒的血清型眾多，流行毒株也有地域差異[8-10]。

1 發(fā)病情況

重慶某養(yǎng)殖場140日齡的海蘭褐殼蛋雞4 000只，由于氣溫驟降，引起雞群應(yīng)激反應(yīng)，雞群中少數(shù)雞表現(xiàn)精神不振、采食和飲水下降、張口呼吸、甩鼻、羽毛粗亂、產(chǎn)蛋量下降癥狀，病雞出現(xiàn)消瘦、拉稀，部分癥狀嚴(yán)重的雞只死亡。

2 病理剖檢

對死亡雞只進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)有黏液，氣管環(huán)出血或氣管內(nèi)有黏液性分泌物，卵泡充血、出血，腎臟腫大、表面有尿酸鹽沉積，呈現(xiàn)花斑腎，見圖1。

圖1 花斑腎

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

依據(jù)臨床發(fā)病情況和病理剖檢可初步進(jìn)行診斷，進(jìn)一步診斷應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室RT-PCR診斷。

3.1 病料處理

無菌采集3份病死雞的氣管和腎臟，剪碎，按1∶5的比例加入無菌生理鹽水進(jìn)行研磨，研磨后的病料反復(fù)凍融3次后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液。

3.2 引物的設(shè)計與合成

依據(jù)《GB/T 23197-2008雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》，在寶生物工程（大連）有限公司合成雞傳染性支氣管炎病毒PCR引物：反轉(zhuǎn)錄引物5'-AGCAAAAGCAGG-3'，所用引物序列見表1。

表1 雞傳染性支氣管炎基因片段RT-PCR擴(kuò)增引物

3.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

分別取3份上清液250 μL，按照TRIZol LS Regent操作方法提取病毒RNA，將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄總體積為20 μL，20 μL反應(yīng)體系為：RNA模板7 μL，10 pmol·L-1反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物1 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，65 ℃水浴5 min、冰浴 2 min 后，加入 5×Buffer 4 μL，0.1 mol·L-1DTT 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，37 ℃ 2 min，加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，37℃水浴50 min，70℃水浴15 min，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-20℃保存。

3.4 RT-PCR擴(kuò)增

PCR混合引物為4PS：包括兩對引物（Ms/Mx和3's/3'x）分別針對傳染性支氣管炎病毒（IBV）基因組的M基因及基因組3'末端的非編碼區(qū)，這兩個基因區(qū)間保守性強(qiáng)。該混合物引物中，Mx/Ms引物濃度為4 pmol·μL-1，3's/3'x的引物濃度為5 pmol·μL-1。

PCR反應(yīng)體系為：無RNase水18.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，12.5 mmol· L-1dNTPs 2 μL，4PS PCR混合引物1.5 μL，2.5U Taq酶0.5 μL，混勻后，加入反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板2 μL，混勻。同時，設(shè)立以傳染性支氣管炎病毒M41株的cDNA為模板的陽性IBV病毒對照和以DEPC水為模板的陰性對照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3min，94℃ 40 s，53℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃7 min。

3.5 電泳檢測

待PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個PCR樣品取5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的2.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳，同時加入5 μL的1 000 bp的Mark作為參照，在120 V恒壓電泳中20 min，取凝膠置紫外成像儀觀察。電泳檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，病料1和2可見清晰的目的條帶，為雞傳染性支氣管炎病毒陽性，病料3為陰性。

圖2 PCR電泳結(jié)果

4 治療和預(yù)防

4.1 治療

對發(fā)病雞只進(jìn)行隔離治療，使用抗生素類藥物進(jìn)行緊急治療，鏈霉素和復(fù)方新諾明按使用說明書2～3倍劑量接種治療。未發(fā)病的雞群，進(jìn)行新支二聯(lián)苗的4倍劑量接種。

4.2 預(yù)防

4.2.1 疫苗接種

可根據(jù)雞場附近的流行毒株選用適用的疫苗，進(jìn)行科學(xué)的免疫[11-12]。雛雞的基礎(chǔ)免疫采用活疫苗免疫，加強(qiáng)免疫采用活疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫。雞傳染性支氣管炎病的免疫程序建議如下：蛋雞7 d時NDV H120二聯(lián)苗2倍量點(diǎn)眼免疫，21 d時NDV H52二聯(lián)苗3倍量點(diǎn)眼免疫，56 d時NDV H52二聯(lián)苗3倍量點(diǎn)眼免疫，98 d時NDV H52二聯(lián)苗4倍量點(diǎn)眼免疫，133 d時NDV H52二聯(lián)苗4倍量點(diǎn)眼免疫，以后每隔45 d做1次NDV H52二聯(lián)苗4～5倍量點(diǎn)眼免疫；肉雞為1～7日齡分別進(jìn)行新支的二聯(lián)苗2倍量點(diǎn)眼免疫。此外，調(diào)查同一地區(qū)的幾年雞傳染性支氣管炎的流行趨勢，對選擇疫苗及防控疫病的發(fā)生具有重大的經(jīng)濟(jì)意義[13-15]。

4.2.2 科學(xué)的飼養(yǎng)管理

雞傳染性支氣管炎病不分季節(jié)、不分日齡、不分品種均可發(fā)生[16-18]。要進(jìn)行全進(jìn)全出的飼養(yǎng)制度，減少持續(xù)感染的幾率；在進(jìn)雛前，對育雛舍進(jìn)行徹底消毒，做好育雛舍的保溫工作，溫度、濕度要恒定，避免冷、熱應(yīng)激；提高飼養(yǎng)條件，保證良好的通風(fēng)，控制飼養(yǎng)密度，適應(yīng)飼養(yǎng)周期；不同的飼養(yǎng)周期選用合理的飼料配方，增加礦物元素和維生素，提高雞群的免疫力；對進(jìn)出場區(qū)的人員、車輛、物品進(jìn)行消毒后，才能準(zhǔn)入，嚴(yán)禁人員串舍，從而降低病毒傳播幾率[19-24]。

5 結(jié)論

該雞場在產(chǎn)蛋前未接種過新支二聯(lián)苗進(jìn)行來加強(qiáng)免疫，產(chǎn)蛋后由于溫度變化，導(dǎo)致雞群應(yīng)激，引起呼吸道癥狀，進(jìn)而伴隨其他呼吸道疾病的繼發(fā)感染，使疫情變得復(fù)雜。可依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢進(jìn)行初步診斷，進(jìn)一步需用RT-PCR進(jìn)行診斷，該飼養(yǎng)場在發(fā)現(xiàn)病情確診后，緊急進(jìn)行新支的預(yù)防接種，在短時間內(nèi)緩解了病情[25]。因此，只有對傳染性支氣管炎病的防治進(jìn)行科學(xué)的疫苗接種和飼養(yǎng)管理，才能有效提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。