任志華，郭印山*，張軍輝，劉鎮(zhèn)東，高宏艷，李坤，郭修武*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，2017年我國葡萄的栽植面積為81.2萬 hm2，位居世界第二位，鮮食葡萄產(chǎn)量位居世界第一位，在世界葡萄生產(chǎn)中占有重要的經(jīng)濟地位[1]。在我國多個主要葡萄栽培種植地區(qū)，灰霉病的危害非常嚴重[2-3]，嚴重制約著葡萄與葡萄酒的生產(chǎn)[4-5]。葡萄灰霉菌不僅會危害葡萄幼果[6]，成熟期果實[7]，也會危害葉片[8]。目前，主要通過化學(xué)藥劑來控制灰霉病，但是，這會增加成本，而且藥劑的殘留會危害人體健康，長期使用還會造成環(huán)境污染[9]。灰葡萄孢菌具有高基因漂移潛力和較大的種群尺度，是高風險病菌，對環(huán)境的適應(yīng)性強，容易產(chǎn)生抗藥性菌株，而且用藥歷史和用藥水平與抗藥性頻率相關(guān)[10]。而培育出抗病品種是解決問題的根本途徑。因此，優(yōu)質(zhì)高抗品種的培育已經(jīng)成為育種工作的一個重要目標。本研究采用室內(nèi)離體葉片接種法，對‘紅地球’ב金星無核’和‘著色香’ב維多利亞’為親本及雜交后代群體為試驗材料，進行灰霉病抗性鑒定，對兩個群體灰霉病抗性及遺傳傾向進行分析，為今后選育抗灰霉病的葡萄品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為葡萄的兩個雜交群體，為歐亞種‘紅地球’(Red Globe)×歐美雜交種‘金星無核’（Venus Seedless）及其雜交后代群體179株，歐美雜交種‘著色香’（Zhuosexiang）×歐亞種‘維多利亞’（Victoria）及其雜交后代群體192株，取自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄資源圃，植株長勢良好。葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所。

1.2 方法

利用PDA培養(yǎng)基對灰霉菌進行培養(yǎng)。稱取干凈的馬鈴薯切成200 g的小塊置于電飯鍋中，加入自來水1 L，待其沸騰30 min，用兩層紗布趁熱過濾，去除濾渣。濾液補充自來水到1000 mL。加入20 g的瓊脂粉和20 g的葡萄糖攪拌均勻。使用高壓蒸汽滅菌鍋（型號：MLS-3751L-PC）滅菌30 min。在超凈工作臺中進行灰霉菌接種，用封口膜封好之后，轉(zhuǎn)入通用環(huán)境實驗箱（型號：MLR-352H-PC）中，在22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d。采集新生枝條頂端生長點往下第5、6片健康的葉片，平整放在8號自封袋里，封口時留一半不封，便于葉片透氣，編號后將葉片放在冰盒里，及時帶回實驗室進行灰霉菌侵染試驗。用無菌水沖洗葉片3遍。在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪濾紙，濾紙鋪在培養(yǎng)皿的蓋上，并用無菌水將濾紙潤濕，以濾紙完全浸濕但不滴水為宜。每個株系挑選3片洗凈的葉片平鋪在培養(yǎng)皿的底部，葉片的背面朝上，用滅菌烘干之后的濾紙將葉片的水滴吸干。用消毒后的孔徑為7 mm的打孔器在培養(yǎng)5 d后的灰霉菌菌落邊緣打下若干個的菌餅，再用滅菌后的鑷子將菌餅夾起來，菌落的面朝下，倒扣在葉背面上，使得灰霉菌菌絲與葉片接觸，接種到葉片的背面3處不同位置上，避開葉片的主葉脈，并且稍微遠離葉片邊緣，預(yù)留一定的葉面積供灰霉菌侵染擴散。將接菌后的葉片放到通用環(huán)境實驗箱（型號：MLR-352H-PC）中，在溫度為22 ℃，黑暗條件下，相對濕度為90%的條件下培養(yǎng)。葉片接菌24 h后，用滅菌后的鑷子將葉片上的灰霉菌菌絲塊挑出來，然后繼續(xù)在同型號實驗箱中培養(yǎng)4 d?；颐咕臃N葉片5 d后，采用智能葉面積測量儀（型號：YMJ-C）統(tǒng)計葉面積及病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄灰霉菌培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)了5 d后的灰霉菌，培養(yǎng)基周圍菌絲生長旺盛，分布均勻，沒有產(chǎn)生孢子且菌絲為白色，活力及致病力都較強，并且整個PDA培養(yǎng)基上無雜菌生長，保證了灰霉菌的純度，符合侵染要求。

2.2 ‘紅地球’ב金星無核’群體灰霉病抗性鑒定結(jié)果

在實驗室內(nèi)對‘紅地球’ב金星無核’試驗群體的離體葉片進行灰霉菌菌絲侵染。圖1是試驗親本接種灰霉菌菌絲結(jié)果，可明顯看出，‘紅地球’的病斑比‘金星無核’的病斑大。圖2為試驗群體中部分后代單株葉片受到灰霉菌菌絲侵染后發(fā)病情況。結(jié)果顯示，試驗群體單株病斑大小存在明顯差異，抗病性呈現(xiàn)出多態(tài)性。

圖1 葡萄灰霉菌菌絲侵染親本離體葉片結(jié)果Figure 1 The infection of Botrytis cinerea to parental detached leaves

根據(jù)群體灰霉病抗性鑒定所得的表型數(shù)據(jù)可知，母本‘紅地球’的病斑大小為1085.57 mm2，父本‘金星無核’的病斑大小為326.70 mm2，供試的179株雜交后代接種灰霉菌后，不同株系間病斑大小有明顯差異，在這些單株中，雖然有51株后代的病斑比‘紅地球’的病斑大，超高親率為28.49%，而有28株后代的病斑比父本‘金星無核’小，超低親率為15.64%，但是從后代中選擇抗灰霉病的單株依然有很大的潛力。利用SPSS軟件得到該群體的抗性頻率分布直方圖（圖3），由圖可知雜交后代群體灰霉病抗性呈現(xiàn)連續(xù)性分布，具有典型的數(shù)量性狀遺傳的特征。

圖2 試驗群體部分后代發(fā)病情況Figure 2 The lesion area identification of some offspring in the experimental group

圖3 ‘紅地球’ב金星無核’群體灰霉病抗性分布Figure 3 Botrytis cinerea resistance distribution histogram of offspring from 'Red Globe'×'Venus Seedless'

2.3 ‘著色香’ב維多利亞’群體灰霉病抗性鑒定結(jié)果

在試驗室里對‘著色香’ב維多利亞’群體的離體葉片進行灰霉菌菌絲侵染。圖4是試驗親本接種灰霉菌菌絲結(jié)果，從圖中可明顯看出，‘維多利亞’的病斑比‘著色香’的病斑大。圖5為試驗群體中部分后代單株葉片受到灰霉菌菌絲侵染后發(fā)病情況。結(jié)果顯示，試驗群體單株病斑大小存在明顯差異，抗病性呈現(xiàn)出多態(tài)性，呈連續(xù)性分布，具有典型的數(shù)量性狀遺傳特征。

圖4 葡萄灰霉菌菌絲侵染親本離體葉片結(jié)果Figure 4 The infection of Botrytis cinerea to parental detached leaves

圖5 試驗群體部分后代發(fā)病情況Figure 5 The lesion area identification of some offspring in the experimental group

根據(jù)群體灰霉病抗性鑒定所得的表型數(shù)據(jù)可知，母本‘著色香’的病斑大小為523.90 mm2，父本‘維多利亞’的病斑大小為1240.96 mm2，供試的192株雜交后代接種灰霉菌之后，不同株系間病斑大小有明顯差異。在這些單株中，有23株后代的病斑比父本‘維多利亞’的病斑大，超高親率為11.98%，而有29株后代的病斑比母本‘著色香’的病斑小，超低親率為15.10%，變異系數(shù)為37.80%，說明從后代中選擇抗灰霉病的單株的潛力較大。利用SPSS軟件得到該群體的抗性頻率分布直方圖（圖6），由圖可知雜交后代群體灰霉病抗性呈現(xiàn)連續(xù)性分布，具有典型的數(shù)量性狀遺傳的特征。

2.4 雜交后代抗灰霉病的遺傳分析

由表1可以看出，在‘紅地球’ב金星無核’雜交群體中，‘金星無核’的抗病性顯著高于‘紅地球’，雜交組合的變異系數(shù)為56.18%，雜交后代的病斑大小分布范圍為127.27～2364.44 mm2，后代的病斑大小的平均值高于親中值，說明后代群體灰霉病抗性受‘紅地球’的影響較大。在‘著色香’ב維多利亞’的雜交群體后代中，‘著色香’的抗病性顯著高于‘維多利亞’，雜交組合后代的變異系數(shù)為37.80%，雜交后代的病斑大小分布范圍分別為200.11～1799.41 mm2，后代的病斑大小的平均值低于親中值，說明后代群體的灰霉病抗性受‘著色香’的影響較大。兩個雜交組合后代中都出現(xiàn)了一定比例的超低親單株，具有較大的選擇抗病單株的潛力。

圖6 ‘著色香’ב維多利亞’群體灰霉病抗性分布Figure 6 Botrytis cinerea resistance distribution histogram of offspring from 'Zhuosexiang'×'Victoria'

3 討論與結(jié)論

葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）即葡萄孢霉，是一種廣泛寄生性的腐生菌。溫度是灰霉菌生長繁殖的關(guān)鍵因子。灰霉菌的菌絲生長適合溫度區(qū)間為2～31 ℃，最適合溫度區(qū)間為20～23 ℃，濕度達到90%以上時灰霉菌生長最好[11]。而光照對灰霉菌菌絲的生長幾乎沒有什么影響[12]。一些營養(yǎng)物質(zhì)也會對葡萄灰霉菌生長和繁殖帶來一定的影響。本試驗中，參照前人研究基礎(chǔ)及預(yù)試驗結(jié)果，采用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，在溫度為22 ℃，濕度為90%，暗條件下的通用型環(huán)境實驗箱中培養(yǎng)灰霉菌及接菌后的離體葉片。

葡萄灰霉病的抗性遺傳研究中，如何保證灰霉病抗性鑒定準確性是關(guān)鍵之處。灰霉病是一種灰葡萄孢菌引起的真菌病害，不僅能夠引起葡萄花序和果實的病害，也能夠致使新梢、嫩葉和莖等部位受損[13]。而在灰霉病抗性鑒定中，主要通過灰霉菌孢子和灰霉菌菌絲進行侵染，侵染的部位主要是葡萄果實和葉片。本試驗結(jié)合前人研究基礎(chǔ)及預(yù)試驗結(jié)果，利用灰霉菌菌絲在室內(nèi)侵染葡萄離體葉片，通過智能葉面積測量儀測定灰霉菌病斑大小進行測定，設(shè)置試驗單株葉片多次重復(fù)，然后對每個單株、每個重復(fù)進行求平均值，使計算得到的病斑面積更加準確。在室內(nèi)進行人工接種，保證了植株可以和病菌均勻接觸，而且侵染的環(huán)境容易控制，既可以反映植株在田間的感病性，又可以避免環(huán)境的不穩(wěn)定性，但是鑒于葡萄對灰霉病抗性遺傳的復(fù)雜性，因此在今后的試驗中，從多方面進行研究，還將結(jié)合多年的田間自然鑒定，更加精確的鑒定葡萄灰霉病抗性[14]。

表1 葡萄雜交后代抗病性的遺傳變異Table 1 Genetic variation of disease resistance in hybrid offspring of grape

迄今，培育出抗性高且優(yōu)質(zhì)的新品種，一直都是國內(nèi)外研究者的目標?？共》N質(zhì)資源成為主要的研究對象。葡萄灰霉病抗性種質(zhì)資源的篩選和鑒定研究也有相關(guān)報道。Gabler等[15]發(fā)現(xiàn)使用灰葡萄孢子侵染42個不同品種的成熟漿果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有較高抗性的品種是圓葉葡萄和美洲葡萄。段慧[16]探究了灰霉菌誘導(dǎo)4種刺葡萄基因型，檢測相關(guān)基因的表達量，確定了2種感病葡萄和2種抗病葡萄，2號和3號刺葡萄具有感病性，1號和4號刺葡萄具有抗性。姜彩鴿等[17]利用孢子懸浮液侵染將6個不同葡萄品種的果實刺傷，對各葡萄品種的內(nèi)含物－花青素、酚類物、糖分、總抗壞血酸或VC及VE等進行檢測，鑒定出了不同葡萄品種對灰霉病抗性的強弱順序為‘赤霞珠’‘美樂’‘西拉’‘雷司令’‘霞多麗’‘白詩南’。萬然[18]利用灰霉菌孢子懸浮液對葉片進行侵染，對我國30份野生葡萄種質(zhì)資源進行了對灰霉菌的抗性調(diào)查，證明了中國野生葡萄種質(zhì)資源中存在對灰霉菌具有抗性的葡萄基因型，抗性最高的6個基因型都來自中國野生葡萄種質(zhì)，即山葡萄‘雙優(yōu)’‘通化3號’和‘泰山-11’；燕山葡萄‘燕山-1’和秦嶺葡萄‘平利-5’和蘡薁葡萄‘泰山-2’。本研究選用歐亞種‘紅地球’和‘維多利亞’、歐美雜交種‘金星無核’和‘著色香’為試驗材料，由試驗結(jié)果可知，‘金星無核’的抗病性顯著高于‘紅地球’，‘著色香’的抗病性顯著高于‘維多利亞’。這兩個雜交后代群體對灰霉病的抗病性均發(fā)生顯著分離，呈連續(xù)性分布，且分布廣泛，表現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特征?！t地球’和‘金星無核’雜交后代群體的變異系數(shù)為56.18%，超高親率為28.49%，說明后代受‘紅地球’的影響比較大?！恪汀S多利亞’后代群體的抗病性的變異系數(shù)為37.80%，超低親率達到15.10%，說明群體后代受‘著色香’的影響較大，后代中選育抗灰霉病單株的潛力較大。這些群體是開展葡萄灰霉病遺傳研究的良好材料，今后我們進一步深入開展研究，結(jié)合分子遺傳圖譜，完成灰霉病抗性QTL定位，篩選抗病候選基因，為今后開展葡萄灰霉病分子標記輔助育種及調(diào)控機制研究提供理論依據(jù)。