孫鑫，劉倩文，李坤*，郭修武*，郭印山，劉鎮(zhèn)東

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110161）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2016年世界葡萄的栽植面積已達(dá)751.6萬 hm2，產(chǎn)量為7580萬 t[1]。然而隨著連作年限的増加，大范圍的葡萄栽培區(qū)都出現(xiàn)了連作障礙?，F(xiàn)已證實(shí)自毒作用是葡萄連作障礙發(fā)生的重要原因，且對(duì)羥基苯甲酸（4-HBA）是葡萄根系分泌的主要酚酸類自毒物質(zhì)[2]。酚酸類物質(zhì)能通過改變抗氧化酶活性而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。陳天祥等[3]研究發(fā)現(xiàn)，50～150 mg/kg 4-HBA和苯丙烯酸處理顯著促進(jìn)設(shè)施黃瓜幼苗體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD)活性的增加。李自龍等[4]發(fā)現(xiàn)150～200 mg/L外源酚酸（4-HBA、香草酸、阿魏酸）處理顯著提高了馬鈴薯葉片的丙二醛（MDA）含量，并對(duì)應(yīng)著抗氧化酶活性的整體下降。自毒物質(zhì)不僅能夠影響植株的生長(zhǎng)，而且還能改變根系分泌特性，進(jìn)而對(duì)根際微生態(tài)產(chǎn)生影響。李勇等[5]利用鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸二異丁酯、苯甲酸等自毒物質(zhì)處理人參，結(jié)果表明處理后大多數(shù)人參根系分泌的酚類和酚酸類物質(zhì)種類均有所増加。董彥[6]選用根系及土壤浸提液對(duì)平邑甜茶幼苗進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)抑制了根系分泌物中的苯甲酸、4-HBA、根皮苷和沒食子酸，促進(jìn)咖啡酸分泌。根系浸提液還促進(jìn)根皮素，抑制兒茶素的分泌，土壤浸提液可以促進(jìn)肉桂酸的分泌?？梢?，自毒物質(zhì)不僅能夠影響植株的抗氧化酶活性，而且還能改變根系的分泌特性。本試驗(yàn)以‘貝達(dá)’實(shí)生苗為試材，采用4-HBA對(duì)葡萄進(jìn)行脅迫處理，研究根系保護(hù)酶、酚酸代謝關(guān)鍵酶活性及根系分泌酚酸含量的變化，旨在明確4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’葡萄幼苗造成脅迫的自毒作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘貝達(dá)’葡萄（V.riparia×V.labrusca，Beta）實(shí)生苗。種子取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試驗(yàn)基地，層積處理后，先用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒20 min，再用自來水浸泡24 h，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光催芽，在種子露白時(shí)播種。試驗(yàn)用基質(zhì)為土∶草炭∶沙子＝6∶3∶1（v/v），播種于營養(yǎng)土中后放到光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照和黑暗對(duì)應(yīng)時(shí)間為14 h和10 h，對(duì)應(yīng)溫度分別為26 ℃和19 ℃。光照度為4000 Lx，相對(duì)濕度75%，每隔1 d用自來水澆灌。

1.2 4-HBA處理

在‘貝達(dá)’幼苗長(zhǎng)出4～5片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，將其小心從土壤中取出，放入裝有3.5 L 1/8 Hoagland營養(yǎng)液的塑料方盆中。每盆20株，根部避光培養(yǎng)，利用增氧機(jī)每隔30 min通氣15 min。在水培條件下預(yù)培養(yǎng)3 d后，向營養(yǎng)液中加入濃度分別為0 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的4-HBA溶液（其標(biāo)準(zhǔn)液用0.3%的乙醇溶液配制），0 μmol/L處理作為對(duì)照（CK）。將培養(yǎng)液敞口放置過夜，使酒精充分揮發(fā)。分別在處理后的當(dāng)天、第24、48、96 h采集葡萄根系。將根系保存于-80 ℃冰箱中，用于測(cè)定SOD、MDA、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等指標(biāo)。

1.3 植株生物量的測(cè)定

‘貝達(dá)’植株的株高和地上、地下鮮重均在處理后96 h取樣測(cè)量，采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)量?！愡_(dá)’葡萄株高采用卷尺進(jìn)行測(cè)量，范圍包括莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)到莖的基部；幼苗的地上部和根系用清水沖洗，用紙擦干，測(cè)定鮮重。

化感作用效應(yīng)敏感指數(shù)（R I）的計(jì)算采用Willianmson的方法[7]。RI＝1－C/T(T≥C)，RI＝T/C－1(T＜C)。式中，C代表對(duì)照值，T代表處理值。當(dāng)RI＞0時(shí)，則表示促進(jìn)作用；當(dāng)RI＜0時(shí)，則表示抑制作用?；凶饔玫膹?qiáng)度可通過RI絕對(duì)值的大小來表示。

1.4 植株生理生化指標(biāo)的測(cè)定

SOD活性按照Giannopolities和Ries的氮藍(lán)四唑法測(cè)定并加以修改[8]。MDA含量按照Kramer[9]中描述的硫代巴比妥酸法測(cè)定。PAL活性測(cè)定按照焦蒙麗等[10]的方法并稍作改動(dòng)。酶液提?。悍Q取葡萄根系樣品0.5 g，加入5 mL在4 ℃下預(yù)冷的提取介質(zhì)（含0.05 mol/L硼酸緩沖液、5.0 mmol/L巰基乙醇、5%甘油、1.0 mmol/L EDTA-Na2，pH8.8）和少量pvp，在冰浴下迅速研磨成勻漿后過濾，濾液在4 ℃下4000 r/min離心15 min，吸取上清液，用于檢測(cè)酶活性。

酶活性的測(cè)定體系中包括0.5 mL粗酶液，2 mL pH8.8的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸和1 mL的蒸餾水，對(duì)照組將L-苯丙氨酸換為同等體積的蒸餾水。將反應(yīng)液于30 ℃水浴60 min后，加入0.2 mL 6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。在290 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以每分鐘OD值變化0.1為一個(gè)酶活單位U。

1.5 根系分泌物中酚酸含量測(cè)定

根系分泌物的收集：取長(zhǎng)有4～5片真葉、長(zhǎng)勢(shì)一致的‘貝達(dá)’實(shí)生苗，小心去掉根部的土壤，將20株葡萄苗放入裝有1 L蒸餾水的小桶中，利用增氧機(jī)每隔30 min通氣15 min，每5 h收集一次，共收集5 L，收集液即為根系分泌物，置于4 ℃保存。將5 L收集液混勻、定容、過濾，于40 ℃下減壓濃縮至25 mL。將已濃縮的25 mL根系分泌物通過XAD-4樹脂柱，利用5倍柱體積的甲醇解析后，于40 ℃下減壓濃縮至干，溶于1 mL甲醇，待測(cè)。

液相色譜檢測(cè)條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為0.1%的甲酸和甲醇，梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，VWD檢測(cè)器，波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

4-HBA標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝77.178x＋0.6084，R2＝0.9986；香草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝81.839x＋0.3741，R2＝0.9997；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝14.577x＋0.9582，R2＝0.9987；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝19.975x－0.3002，R2＝0.9995；水楊酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝139.38x－0.7239，R2＝1；肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝60.442x＋0.4587，R2＝0.9978。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)利用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析選用ANOVA過程，采用Tukey's HSD test顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’葡萄幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可以看出，總體來說4-HBA處理抑制了‘貝達(dá)’葡萄水培幼苗的生長(zhǎng)。除250 μmol/L 4-HBA處理后，地下鮮重高于對(duì)照外，其他濃度4-HBA對(duì)株高、地上鮮重、地下鮮重均有抑制作用，并且隨著4-HBA濃度的提高抑制作用越顯著。3種4-HBA濃度處理下，植株高度分別比對(duì)照降低了1.96%、5.73%、5.80%，地上鮮重分別比對(duì)照降低了24.80%、38.68%、58.66%。4-HBA對(duì)地下鮮重的影響呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制的現(xiàn)象。

2.2 4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系SOD活性的影響

如圖1所示，在處理后24 h，4-HBA濃度為250、500 μmol/L時(shí)，SOD活性較對(duì)照分別降低4.29%和7.94%。在處理后48 h，所有處理SOD酶活性均高于對(duì)照，分別上調(diào)了26.56%、15.33%、9.65%。在處理后96 h，500 μmol/L和1000 μmol/L處理下，SOD活性顯著低于對(duì)照，分別降低了19.38%和23.89%。結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度4-HBA可提高‘貝達(dá)’葡萄水培幼苗根系SOD活性，而高濃度4-HBA則抑制根系SOD活性，抑制植株生長(zhǎng)。從處理時(shí)間來看，在處理后的48 h，SOD活性達(dá)到峰值。

2.3 4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系PAL活性的影響

圖1 4-HBA處理對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系SOD活性的影響Figure 1 Effect of 4-HBA treatment on SOD activity in 'Beta'seedling roots

表1 4-HBA處理對(duì)‘貝達(dá)’幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of 4-HBA on the growth of 'Beta' (V.riparia×V.labrusca cv.) grape seedlings

PAL是促進(jìn)苯丙烷類代謝途徑生成各種酚酸類物質(zhì)的第一步反應(yīng)酶，也是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。PAL與植物抗逆境性密切相關(guān)。由圖2可以看出，PAL活性隨著4-HBA處理濃度的升高，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在處理后24 h，250 μmol/L處理PAL活性較對(duì)照增加了10.66%，500 μmol/L和1000 μmol/L處理PAL活性與對(duì)照無顯著差異。PAL活性在處理后48 h達(dá)到峰值，各處理PAL酶活性均顯著高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.16、1.32、1.24倍。處理后96 h各濃度處理關(guān)鍵酶活性都比處理48 h有所下降。可見，4-HBA脅迫后，葡萄植株能夠通過提高PAL活性來增強(qiáng)植株的適應(yīng)能力。

2.4 4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化過程中最重要的產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生和積累能夠?qū)е履p傷的加劇。在4-HBA處理后24 h，根系MDA含量隨處理濃度增加而增大，較對(duì)照分別增高了7.04%、12.49%、14.54%。處理后48 h，根系MDA含量較對(duì)照分別增高了31.46%、26.02%、37.56%；在4-HBA處理后96 h，高濃度處理根系MDA含量最高，顯著高于對(duì)照及其他處理。

2.5 外源4-HBA對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系分泌酚酸的影響

圖2 4-HBA處理對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系PAL活性的影響Figure 2 Effect of 4-HBA treatment on PAL activity in 'Beta'seedling roots

由表2可以看出，各濃度處理后，根系分泌物中4-HBA含量和阿魏酸含量較高。在處理后4-HBA含量均顯著低于對(duì)照，250 μmol/L處理，根系分泌物中的4-HBA含量最低，僅為對(duì)照的11.86%；500 μmol/L和1000 μmol/L時(shí)，根系分泌物中的4-HBA含量較對(duì)照分別降低了26.59%、55.37%。外源4-HBA處理，促進(jìn)了根系分泌更多的水楊酸。在無4-HBA處理下，根系分泌物中水楊酸酸含量?jī)H0.0409 μg/mL，隨著4-HBA處理濃度增加，根系分泌物中水楊酸酸含量分別達(dá)到了0.61、0.86、5.05 μg/mL。1000 μmol/L 4-HBA處理使根系分泌物中水楊酸含量顯著增加，為對(duì)照的124倍。4-HBA處理下肉桂酸含量均低于對(duì)照，分別比對(duì)照降低了46.00%、26.07%、66.48%，且在4-HBA處理濃度為1000 μmol/L時(shí)，根系分泌的肉桂酸含量最低。4-HBA處理后，改變了根系分泌的苯甲酸含量，在處理濃度為250 μmol/L和500 μmol/L時(shí)，根系分泌苯甲酸含量均低于對(duì)照，分別降低了44.22%和21.91%。而高濃度處理則使根系分泌物中苯甲酸含量顯著增加，為對(duì)照的2.4倍。處理96 h后，在4個(gè)濃度4-HBA處理下，根系分泌物中阿魏酸含量分別為17.89 μg/mL、36.74 μg/mL、62.71 μg/mL、111.03 μg/mL，且阿魏酸含量變化與外源4-HBA濃度呈正相關(guān)。4-HBA處理后，根系分泌的香草酸含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)處理濃度為250 μmol/L時(shí)，香草酸含量達(dá)到峰值，為對(duì)照的1.28倍。當(dāng)4-HBA濃度為1000 μmol/L時(shí)，香草酸含量顯著降低，較對(duì)照降低了37.23%。外源4-HBA處理為250 μmol/L時(shí)，‘貝達(dá)’葡萄水培幼苗根系分泌的總酚酸含量顯著降低，較對(duì)照降低了59.77%。而高濃度4-HBA處理使‘貝達(dá)’葡萄水培幼苗根系分泌出更多的酚酸，較對(duì)照分別增加了22.56%、29.49%，且在4-HBA處理為1000 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值。

圖3 4-HBA處理對(duì)‘貝達(dá)’幼苗根系MDA的影響Figure 3 Effect of 4-HBA treatment on MDA content in 'Beta'seedling roots

表2 4-HBA處理96 h后‘貝達(dá)’葡萄根系分泌物中的酚酸含量 （單位：μmol/L）Table 2 Phenolic content in 'Beta' root exudates under 4-HBA treatment after 96 h (Unit: μmol/L)

3 討論與結(jié)論

在植物正常的生長(zhǎng)條件下，因?yàn)榭寡趸到y(tǒng)的參與，其體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)。SOD是清除超氧陰離子自由基的形成和積累的重要酶類，可以反映出植物抵抗逆境脅迫的能力[11]。而MDA含量是間接測(cè)定植物膜系統(tǒng)受損程度以及抗逆性的一個(gè)常用指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，‘貝達(dá)’葡萄根系SOD酶的活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在處理后96 h，低濃度酚酸促進(jìn)SOD酶活性，高濃度抑制其活性，且與對(duì)照達(dá)到顯著差異。有研究表明，適當(dāng)?shù)牡蜏睾蜐B透脅迫能使SOD等保護(hù)酶活性上升，中間和高濃度使其活性下降[12-13]。本試驗(yàn)隨著外源酚酸處理濃度的增加，MDA的含量大量積累，在不同的處理時(shí)間下，1000 μmol/L的4-HBA處理葡萄根系MDA含量始終高于對(duì)照，并達(dá)到顯著性差異。這一研究結(jié)果與與黃彩紅[14]研究結(jié)果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)隨著外源酚酸處理濃度增加，黃瓜根系MDA含量持續(xù)升高。說明在高濃度酚酸物質(zhì)刺激根系細(xì)胞膜脂過氧化的發(fā)生，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，根系的生理生化過程受阻，超出了抗氧化酶系統(tǒng)的保護(hù)能力。

研究表明，外源脅迫因子可影響次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶，進(jìn)而影響植物次生代謝物的合成和積累量[15]。而植物根系分泌物的組成與含量變化是響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)最明顯和直接的反應(yīng)之一[16]。PAL作為一種生物合成酶，可以催化多種具有防御功能化合物的形成[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理杜鵑葉片可明顯誘導(dǎo)PAL防御酶活性的提高[19]。Latunde等[20]也研究發(fā)現(xiàn)用水楊酸處理豇豆幼苗，500 μmol/L以上就能激活PAL基因的表達(dá)，使PAL酶活性增加。前人在對(duì)洋甘菊根系進(jìn)行外源水楊酸處理后發(fā)現(xiàn)，其PAL酶活性升高，從而導(dǎo)致植株分泌的可溶性總酚含量顯著增加[21]。Zafari等[22]以牧豆樹為試材研究發(fā)現(xiàn)，在鉛（Pb）處理初期，PAL活性與酚類化合物的增加呈正相關(guān)，且隨Pb處理濃度增大，阿魏酸和水楊酸含量均顯著增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn)外源4-HBA處理可以顯著影響‘貝達(dá)’水培幼苗根系的PAL酶活性。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PAL酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在48 h酶活性達(dá)到峰值。且4-HBA處理導(dǎo)致根系分泌的4-HBA，肉桂酸含量減少，水楊酸和阿魏酸含量顯著增加。酚類化合物的積累在植物對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[23-24]，其中水楊酸是能激活植物防御反應(yīng)的重要信號(hào)分子。因此，我們認(rèn)為在外源酚酸脅迫下可刺激葡萄根系分泌出更多的水楊酸來參與植物的防御代謝反應(yīng)。