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(許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 許昌 461000)

香椿[Toonasinensis(A.Juss.)Roem]又名香椿芽、香樁頭、椿天等，屬楝科香椿屬落葉喬木，是藥食兩用植物，在河南、山東、安徽等多地種植[1,2].香椿葉含有黃酮、多酚、三萜類等活性成分[3-5]，具有抑菌、抗氧化、降血糖和抗腫瘤等作用[6,7].市面上現(xiàn)有香椿醬、干制香椿芽、香椿茶和香椿咸菜等產(chǎn)品[1,8].目前，香椿的消費(fèi)以嫩芽為主，老葉常被廢棄.因此，香椿老葉的開發(fā)利用具有重要意義.

目前，化學(xué)合成物是食品主要的抗氧化劑，植物源抗氧化劑受到普遍關(guān)注[9].黃酮類物質(zhì)作為抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用前景[10].香椿葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化香椿葉黃酮的超聲波提取工藝已見報(bào)道[11]；但是基于響應(yīng)面分析的香椿老葉黃酮的超聲波提取工藝未見研究.因此，本研究就對香椿老葉黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其抗氧化性能進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

香椿老葉：2016年8月采摘于河南九棵樹農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.7%，中國藥品生物制品檢定所.乙醇、Vc、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、FeCl3、3,5-二硝基水楊酸等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；超聲波提取機(jī)，濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.3 研究方法

1.3.1 黃酮含量的測定

采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH比色法測定黃酮含量[12].

1.3.2 單因素試驗(yàn)

香椿老葉于鼓風(fēng)干燥箱(50 ℃)中干燥后，粉碎并過60目篩.取1.00 g香椿老葉粉，研究不同的乙醇濃度(20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%)、料液比(15，110，120，130，140，150，160 g/mL)、提取時(shí)間(10，20，30，40，50，60，70 min)、提取溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)和提取功率(320，400，480，560，640，720 W)對香椿老葉黃酮提取率的影響.

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比(X1)、提取時(shí)間(X2)、提取功率(X3)為影響因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化香椿老葉黃酮的提取條件.

1.3.4 抗氧化指標(biāo)測定

根據(jù)上述得到的最優(yōu)工藝，提取香椿老葉黃酮，并烘干(50 ℃)，然后配制成不同濃度的黃酮溶液.測定黃酮的體外抗氧化活性，包括總還原能力[13]、DPPH自由基清除率[14]、ABTS自由基清除率[15]和·OH清除率[16-17].

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，使用軟件DPS 7.05和Design Expert 8.0.5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度小于40%時(shí)，黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而逐漸增加；當(dāng)乙醇濃度為40%～80%時(shí)，提取率則逐漸下降.原因是香椿老葉黃酮隨著乙醇濃度的變化，其極性也發(fā)生變化，40%乙醇的極性與香椿老葉中黃酮的極性相近，此時(shí)的黃酮提取率最高；但是乙醇濃度過高，又會(huì)使雜質(zhì)(如糖類、色素、脂溶性物質(zhì)等)溶出，干擾黃酮的提取.因此，確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳乙醇濃度為40%.

2.1.2料液比對黃酮提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，香椿老葉黃酮的提取率先增加后降低.當(dāng)料液比為130(g/mL)時(shí)，黃酮的提取率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加料液比，提取率則逐漸下降.原因是料液比在一定范圍時(shí)，隨著提取液料液比的增加，黃酮的溶出也逐漸增加；當(dāng)固體和液體接觸飽和后，再增加提取溶劑的量，雜質(zhì)就會(huì)溶出；另外，料液比越高，后續(xù)濃縮工藝需要的時(shí)間會(huì)更長.因此綜合考慮，確定提取香椿老葉黃酮的最佳料液比為130(g/mL).

圖1 乙醇濃度對香椿老葉黃酮提取率的影響

圖2 料液比對香椿老葉黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲波提取時(shí)間的延長，香椿葉黃酮的提取率逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取率最高；再延長提取時(shí)間，香椿老葉黃酮的提取率則降低.原因是隨著時(shí)間的延長，超聲波會(huì)產(chǎn)生較多的熱量，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)將會(huì)遭到破壞；而且超聲波振幅也會(huì)破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu).綜上所述，確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳時(shí)間為40 min.

2.1.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，香椿老葉黃酮的提取率也逐漸增加；當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，黃酮的提取率最高；當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高，香椿老葉黃酮的提取率逐漸下降，其原因是溫度過高會(huì)使黃酮類化合物降解，但溫度過低不利于黃酮類化合物的溶出.因此確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳溫度為50 ℃.

圖3 提取時(shí)間對香椿老葉黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對香椿老葉黃酮提取率的影響

2.1.5 超聲功率對黃酮提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲波功率為400 W時(shí)，香椿老葉黃酮的提取率最大；功率繼續(xù)增加，提取率則逐漸下降.原因可能是功率過高，超聲產(chǎn)生的瞬間高溫會(huì)破壞黃酮化合物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雜質(zhì)溶出，從而影響提取效果.因此確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳功率為400 W.

2.2 超聲波提取工藝條件的優(yōu)化

試驗(yàn)因素水平見表1，表2為Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果.用軟件Design Expert 8.0.5對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以香椿老葉黃酮提取率(Y)為固定量，以料液比(X1)、提取時(shí)間(X2)和提取功率(X3)為因變量，建立數(shù)學(xué)模型方程為

Y=-0.966 85+78.108 20X1+0.224 05X2-0.013 381X3-1.343 20X1X2+0.071 975X1X3+
0.000 002 875X2X3-552.016 00X12-0.002 104 78X22+ 0.000 013 913 7X32.

(1)

圖5 超聲功率對香椿老葉黃酮提取率的影響

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 試驗(yàn)分析方案及結(jié)果

由表3可知，回歸模型差異極顯著(P=0.004 7)、失擬項(xiàng)差異不顯著(P>0.05)，說明該模型擬合度好，可用該模型分析和預(yù)測香椿老葉黃酮的提取率.F檢驗(yàn)用來判定回歸方程中各變量對響應(yīng)值的影響顯著性，概率P越小，相應(yīng)變量的顯著程度越高.A、AB、B2極顯著，B、C2顯著.回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.918 1(校正后R2為0.812 8和變異系數(shù)為3.29)，說明該模型滿足了91.81%的樣本空間.

表3 方差分析表#

注：#**，P<0.01，表示差異極顯著；*，P<0.05，表示差異顯著.

為客觀反映料液比與提取時(shí)間(AB)的交互作用對香椿老葉黃酮提取率的影響，以其中兩個(gè)響應(yīng)變量為x軸和y軸，響應(yīng)值香椿老葉黃酮提取率為z軸，繪制等高線圖和三維響應(yīng)面圖，如圖6所示.

圖6 料液比(A)和提取時(shí)間(C)對香椿老葉黃酮提取率(Y)交互影響的等高線圖(a)和響應(yīng)面圖(b)

對式(1)做進(jìn)一步分析，得到超聲波提取香椿老葉黃酮的最優(yōu)參數(shù)為：料液比為120、提取時(shí)間為37.61 min、提取功率為480 W，預(yù)測香椿老葉黃酮的提取率為3.044%.用最優(yōu)參數(shù)來提取香椿老葉黃酮，測得提取率為(3.051±0.029)%，說明響應(yīng)面法的優(yōu)化工藝參數(shù)是可靠的.

2.3 香椿老葉黃酮的抗氧化活性

圖7為香椿老葉黃酮的總還原能力及·OH、DPPH和ABTS自由基清除率.可知，在所測定的濃度范圍內(nèi)，香椿老葉黃酮具有一定的抗氧化能力.隨著黃酮濃度的升高，其總還原能力、DPPH 自由基清除率和ABTS自由基清除率均增大，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系；但是對·OH的清除能力差異不明顯.香椿老葉黃酮可作為天然食品抗氧化劑，與相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]結(jié)論一致.

圖7 香椿老葉黃酮的·OH清除率注:a為總還原能力，b、c為DPPH自由基清除率，d為ABTS自由基清除率.

3 結(jié)論

(1)香椿老葉黃酮的超聲波提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比為1：20(g/mL)、提取時(shí)間為37.61 min、提取功率為480 W，預(yù)測香椿老葉黃酮的提取率為3.044%(接近測定值3.051%).

(2)香椿老葉黃酮具有一定的抗氧化作用.在一定濃度范圍內(nèi)，香椿老葉黃酮對·OH、DPPH自由基和ABTS自由基具有一定的清除能力.

(3)香椿老葉中黃酮類化合物提取工藝及其抗氧化能力的研究為香椿資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù).試驗(yàn)中所用的是黃酮粗提液，可能含有多酚、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)，香椿老葉中黃酮的組成、結(jié)構(gòu)以及純化等仍需進(jìn)一步研究；另外，本文的抗氧化實(shí)驗(yàn)是體外評價(jià)，還需通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗氧化能力.