沈 訪 李 林 潘胤池 張社波 馬 激 徐德林*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，遵義 563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遵義 563099)

白及(Bletillastriata(Thunb.) Rchb.f.)是醫(yī)藥、工業(yè)、園藝的重要原材料。其假鱗莖是一種常用的中藥材，具有抗菌鎮(zhèn)痛[1～2]、消腫生肌[3]、防治口腔疾病[4]之功效。近年的藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，白及能合成大量的超氧化物，具有抗菌鎮(zhèn)痛及抑制癌細(xì)胞增殖作用[1,5]。此外，白及還被廣泛用作護(hù)膚化妝品、高檔卷煙煙蒂膠、工業(yè)糊料、漿絲綢、漿紗、涂料、釀酒等工業(yè)原料和園藝種植的觀賞花草。然而，白及已被我國(guó)列為珍稀瀕危的中草藥物種，同時(shí)也被國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄二錄入加以保護(hù)[6]，因此，深入了解白及的生物學(xué)特性和基因功能對(duì)白及的資源開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)具有重要意義。

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)廣泛存在于生物細(xì)胞中并行使著十分重要的生物學(xué)功能，是白及等高等植物光呼吸及一碳代謝中的關(guān)鍵酶之一。SHMT在線粒體內(nèi)與甘氨酸脫羧酶復(fù)合體(GDC)共同將葉綠體內(nèi)光合作用生成的甘氨酸(Gly)轉(zhuǎn)化為絲氨酸(Ser)[7]，而Gly和Ser是合成葉綠素、谷胱甘肽、色氨酸、卵磷脂和磷脂、乙醇胺的前體；SHMT也是以5-磷酸吡哆醛(5-PLP)為輔酶的吡哆醛酶,在四氫葉酸(THF)存在的條件下催化合成L-絲氨酸的關(guān)鍵酶[8]，一定條件下，SHMT能夠催化N5,N10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)和甘氨酸(Gly)與L-絲氨酸(Ser)和四氫葉酸的可逆反應(yīng)[9]。同時(shí)伴隨著甲醇、甲醛、甲酸等一碳單位的產(chǎn)生和代謝，在充分利用一碳代謝的同時(shí)消除其對(duì)自身的毒害。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)植物缺少SHMT或甘氨酸脫羧酶(GDC)或酶活性降低時(shí)不能進(jìn)行有氧光合作用,多數(shù)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)延遲[10]，Bornke F[11]等人認(rèn)為SHMT可作為除草劑作用的新靶點(diǎn)，當(dāng)編碼含有SHMT肽段的核苷酸序列缺失時(shí)植物會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩或葉片萎黃。研究植物的SHMT基因功能對(duì)認(rèn)識(shí)相關(guān)化合物的代謝和對(duì)該基因的工程應(yīng)用具有重要意義。

目前關(guān)于白及SHMT基因序列信息和蛋白結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從前期構(gòu)建的白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選取出SHMT基因的全長(zhǎng)序列,利用系列生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因進(jìn)行氨基酸序列、理化性質(zhì)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及蛋白質(zhì)信號(hào)肽的分析，并分析白及SHMT基因核苷酸和氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以期為該基因的功能驗(yàn)證和基因的應(yīng)用研究提供理論指導(dǎo)，也為植物SHMT基因的分子研究提供基礎(chǔ)資料與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用白及資源系本課題組采自貴州省正安縣的當(dāng)?shù)卦耘嗥废?，由遵義醫(yī)學(xué)院錢剛教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

提取白及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、根莖葉的總RNA進(jìn)行等量混合成一個(gè)混樣(mix)，平分成兩份，mix1和mix2。將mix1和mix2分別進(jìn)行5G數(shù)據(jù)量的mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(測(cè)序由蘇州吉塞基因測(cè)序科技有限公司在Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)上完成)，然后用Trinity Method軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果中的高質(zhì)量reads進(jìn)行de novo組裝成兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步將兩個(gè)組裝數(shù)據(jù)庫(kù)中共有的unigene序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行常規(guī)的信息學(xué)注解，從中挑選出被初步注解為SHMT基因的序列(NCBI登錄號(hào)：MG544187)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 核苷酸和氨基酸序列特征分析

用NCBI的在線Blast對(duì)該序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步用ORF Finder檢測(cè)其開(kāi)放閱讀框,再利用DNAMAN軟件進(jìn)行多物種氨基酸序列的多重比對(duì)，然后用MEGA5.10軟件的臨接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 理化性質(zhì)分析

應(yīng)用Expasy網(wǎng)站的Protparam tool程序(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)SHMT進(jìn)行氨基酸含量與理論分子量及等電點(diǎn)的分析,利用ProtScale程序(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的疏水性分析。

1.2.4 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)進(jìn)行目的序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,應(yīng)用InterProScan(http://www.ebl.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)和GenBank目的序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析,用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

圖1 SHMT氨基酸序列特征及比對(duì)結(jié)果 AFK83583.1：大豆；MG544187：白及；XP_020683851.1：鐵皮石斛；EOY05144.1：可可樹(shù)；XP_003601683.1：蒺藜苜蓿；XP_007222930.1 ：桃樹(shù)；XP_021689869.1：橡膠樹(shù)；ANU05566.1： 野生大豆；ABO61381.1：美洲山楊；XP_022734347.1：榴蓮；XP_020107001.1：菠蘿；KHG17052.1：樹(shù)棉；XP_002522806.1：蓖麻；Consensus：序列相似性 黑色背景表示相似性為100%；粉紅色表示相似性大于等于75%；青綠色表示相似性大于等于50% 下同。Fig.1 Amino acid sequence characteristics and multiple alignment results of SHMT AFK83583.1：Glycine max； MG544187：B.striata； XP_020683851.1：Dendrobium catenatum； EOY05144.1：Theobroma cacao； XP_003601683.1：Medicago truncatula； XP_007222930.1 ：Prunus persica； XP_021689869.1：Hevea brasiliensis； ANU05566.1： Glycine soja； ABO61381.1：Populus tremuloides； XP_022734347.1：Durio zibethinus； XP_020107001.1：Ananas comosus； KHG17052.1：Gossypium arboreum； XP_002522806.1：Ricinus communis Identical amino acids are highlighted in black; Amino acids similarity in at least 75% are highlighted in pink; Amino acids similarity in at least 50% are highlighted in aomidori The same as below.

1.2.5 功能分析

運(yùn)用在線工具WOLFPSOPRT(http://wolfpsort.org/)進(jìn)行序列的亞細(xì)胞定位分析、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列分析

ORF finder對(duì)編號(hào)為目標(biāo)序列的開(kāi)放閱讀框分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長(zhǎng)1 953 bp，包括一個(gè)完整的讀碼框，共編碼471個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)NCBI的在線Blast對(duì)比及注解初步證實(shí)該序列是SHMT基因。應(yīng)用軟件DNAMAN進(jìn)行多物種氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)白及SHMT基因的氨基酸序列與鐵皮石斛、蒺藜苜蓿、可可樹(shù)、美洲山楊、樹(shù)棉、橡膠樹(shù)等植物的SHMT基因序列有同源性(圖1)，說(shuō)明該基因在植物中的序列具有非常高的保守性,從比對(duì)中發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)保守區(qū)域，進(jìn)一步證實(shí)該基因?yàn)镾HMT基因。相似性比對(duì)還發(fā)現(xiàn)白及SHMT的氨基酸序列與鐵皮石斛氨基酸(GeneBank登錄號(hào)：XP_020683851.1)的相似性最高，達(dá)93%。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將SHMT基因氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，選擇相似性高的氨基酸序列用MEGA5.10軟件構(gòu)建物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap方法試驗(yàn)引導(dǎo)復(fù)制次數(shù)為1 000次，遺傳距離標(biāo)尺為0.01。分析結(jié)果如圖2所示，其結(jié)果表明白及與其它物種的SHMT基因，如可可樹(shù)(T.cacaoXP_007034218.1)、樹(shù)棉(G.arboreumKHG17052.1)、榴蓮(D.zibethinusXP_022734347.1)、美洲山楊(P.tremuloidesABO61381.1)、蒺藜苜蓿(M.truncatulaXP_003601683.1)等表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；同為單子葉植物，與大葉藻(Z.marinaKMZ63006.1)、玉米(Z.maysACG33080.1)的親緣關(guān)系仍較遠(yuǎn)。而與蘭科植物鐵皮石斛(D.catenatumXP_020683851.1)、蝴蝶蘭(P.equestrisXP_020573994.1)同處一分支，親緣關(guān)系最近，序列相似性達(dá)80%。

圖2 SHMT氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences in SHMT

2.3 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

經(jīng)在線軟件分析，白及SHMT蛋白序列分子量為51.801 06 kD、理論等電點(diǎn)pI為7.17，原子組成為C2324H3614N626O687S17，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)53個(gè),負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)53個(gè)，為堿性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為41.3(>40)，表明該蛋白不穩(wěn)定。疏水性結(jié)果分析表明，該蛋白為親水性蛋白,親水峰最大值為-0.298，位于第28位氨基酸，該處蛋白質(zhì)表現(xiàn)出最強(qiáng)親水性，其平均親水值為-3.256；最大疏水值為2.222，位于第299位氨基酸，在該蛋白中說(shuō)明該處的疏水性最強(qiáng)。

圖3 蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果 疏水峰值大于0，親水峰值小于0，橫軸表示氨基酸位置。Fig.3 Protein hydrophobicity analysis Hydrophobic peak is greater than 0,hydrophilic peak is less than 0,the horizontal axis represents the amino acid position.

2.4 SHMT的保守結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

InterProScan在線工具預(yù)測(cè)SHMT保守結(jié)構(gòu)域，共有6個(gè)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)SHMT家族、1個(gè)位于236-252位(PS00096)的磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。SHMT保守結(jié)構(gòu)域主要含磷酸吡哆醛轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，分別位于6-462位(SSF53383)、41-303位(G3DSA:3.40.640.10)、304-460位(G3DSA:3.90.1150.10)，以及3個(gè)未明確分類的保守結(jié)構(gòu)域(其中2個(gè)分別被命名為SHMT、Serine Hydroxymethyltransferase)，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔扉T冬氨基酸超家族，能催化Ser與THF反應(yīng)生成Gly和CH2-THF的可逆反應(yīng)；2個(gè)SHMT家族分別位于1-466位(PIRSF000412)、15-4424位(cd00378)圖4B為應(yīng)用GeneBank對(duì)該氨基酸進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該基因中含有一個(gè)催化殘基的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏AT-I家族，這與InterProScan在線軟件的分析結(jié)果一致。

圖4 SHMT的保守結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 A. InterProScan分析出的結(jié)構(gòu)域；B. GeneBank的Conserved domains分析出的結(jié)構(gòu)域；C.二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(橫軸表示氨基酸位置，藍(lán)色表示α-螺旋，紅色表示無(wú)規(guī)則卷曲)；D.螺旋結(jié)構(gòu)模型；E.球形結(jié)構(gòu)模型Fig.4 Conserved domain prediction and secondary structure,tertiary structure prediction of SHMT A. Analysis of the domain of SHMT with InterProScan prediction; B. Forecast of the domain of SHMT with conserved domain in GeneBank,respectively; C. Horizontal axio indicates amino acid site( blue indicates Alpha helix; Red indicates Random coil); D. Helices model of SHMT; E. Ball model of SHMT

用SOPMA對(duì)白及SHMT進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖4C)。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)(Alpha helix)為38.85%，線狀結(jié)構(gòu)為(Extended strand)18.26%，β折疊結(jié)構(gòu)(Beta turn)為10.83%,無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)為32.06%。表明該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分為α螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。用同源建模原理，通過(guò)SWISS-MODEL軟件得到SHMT的三維結(jié)構(gòu)模型(圖4:D～E)，分析出SHMT的QMEAN4模型數(shù)據(jù)(表1)。從表1中可以看出得到的三維結(jié)構(gòu)模型具有可靠性。

表1 SHMT的QMEAN4值Table 1 QMEAN4 global scores of SHMT

2.5 SHMT信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用在線軟件對(duì)白及SHMT的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)，結(jié)果顯示第18位氨基酸殘基為最高，分值為0.136；而第52位氨基酸殘基具有最高的信號(hào)肽，分值為0.130，第18位為最高綜合剪切位點(diǎn)，分值為0.117，推斷SHMT無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。其mean S-score值為0.098，由此推斷，SHMT也不是分泌蛋白。SHMT含有跨膜結(jié)構(gòu)域總概率為0.004 47，遠(yuǎn)小于1，所以預(yù)測(cè)其無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步佐證該蛋白缺乏信號(hào)肽的推斷，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該酶定位于細(xì)胞質(zhì)與葉綠體中。

圖5 SHMT信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Signal sequence prediction of SHMT

3 討論

SHMT克隆與表達(dá)調(diào)控方面的研究在擬南芥、大豆、可可樹(shù)、豌豆等植物中已有相應(yīng)的報(bào)道，其中，以擬南芥的SHMT得到較為深入的研究。通過(guò)對(duì)白及SHMT核苷酸及氨基酸序列分析表明，圖1中紅色標(biāo)記部分表示SHMT的三個(gè)高度保守區(qū)域，分別為第55-71位“LTNKYSEGMPGNRYYGG”、第132-138位“GGHLTHG”，這與MC Hong[12]等人在AnSHMT中檢測(cè)出的保守區(qū)域是一致的。也佐證了該蛋白是具有高度保守性的功能蛋白。此外，第285～290位為一個(gè)富含甘氨酸氨基酸序列“SLQGGP”的高度保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)為磷酸吡哆醛的必須結(jié)合位點(diǎn)[13]。植物中與5-磷酸吡哆醛(5-PLP)結(jié)合后的SHMT能夠催化N5,N10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)和甘氨酸(Gly)與L-絲氨酸(Ser)和四氫葉酸之間的相互轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的甘氨酸(Gly)與絲氨酸(Ser)為葉綠素、谷胱甘肽、卵磷脂和磷脂、乙醇胺前體的合成提供原材料，植物中SHMT基因的高度保守性，并未因物種進(jìn)化而產(chǎn)生極大差異，也正是因?yàn)镾HMT的序列的這種保守性，使得許多學(xué)者將古細(xì)菌的SHMT作為研究方向，尤其是極端環(huán)境中生長(zhǎng)的細(xì)菌。

Soulages JL[14]等人的研究認(rèn)為高度親水性及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)使得蛋白具有三個(gè)功能：(1)作為水分結(jié)合蛋白減少水分喪失；(2)作為水和緩沖劑調(diào)節(jié)水狀態(tài)；(3)作為水基質(zhì)或替代物同大分子反應(yīng)阻止脫水組織中蛋白質(zhì)的失活。在白及SHMT蛋白的理化性質(zhì)中也表現(xiàn)出高度親水性，且二級(jí)結(jié)構(gòu)含無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，推測(cè)該蛋白也可能具有減少水分喪失、調(diào)節(jié)水狀態(tài)、作為水基質(zhì)或替代物同大分子反應(yīng)阻止脫水組織中蛋白質(zhì)的失活等功能，具體有待進(jìn)一步研究。

SHMT蛋白的結(jié)構(gòu)在動(dòng)物、植物和微生物之間有顯著差異，功能也有很大不同。哺乳動(dòng)物的SHMT是含有PLP的亞基構(gòu)成的同型四聚體,分子量大約為53 kDa，在純化的大腸桿菌的SHMT蛋白是由相同亞基構(gòu)成的同型二聚體[15]，而嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillussterothermophilus)中分離純化的重組酶是一個(gè)二聚體(90%)和四聚體(10%)的混合物[16],從植物中純化出來(lái)的SHMT則是同型四聚體結(jié)構(gòu)[17]，這可能與SHMT在不同的生物中存在變構(gòu)調(diào)控功能有關(guān)。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，白及SHMT的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)(Alpha helix)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)兩個(gè)元件構(gòu)成，三級(jí)結(jié)構(gòu)為四聚體結(jié)構(gòu)。GeneBank保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明該蛋白有四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域、甘氨酸—磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)、葉酸結(jié)合位點(diǎn)以及二聚體界面結(jié)構(gòu)域，均屬于AAT-I家族，其中以活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域與甘氨酸—磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域保守性最強(qiáng)，該結(jié)構(gòu)域在空間三維結(jié)構(gòu)中的位置如(圖4E)所示。

在高等植物中，SHMT通常以胞質(zhì)和線粒體亞型以及葉綠體型存在，在Crithidia fasciculata的領(lǐng)鞭毛體中檢測(cè)到SHMTⅠ,SHMTⅡ,SHMTⅢ 3種分子形式的SHMT,其中SHMTⅠ是胞質(zhì)型,另外兩種為顆粒狀形態(tài)，即線粒體型(SHMTⅡ)和glycosomal型(SHMT Ⅲ)[18]。在擬南芥中SHMT家族的SHMT1與SHMT2蛋白產(chǎn)物可能被定位于線粒體基質(zhì)中,另外3個(gè)SHMT基因編碼胞質(zhì)SHMT[9]。通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，白及SHMT蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體中，葉綠體中的SHMT參與光呼吸途徑，主要功能是從達(dá)爾文循環(huán)通過(guò)核酮糖-1,5-二磷酸的氧合作用回收利用碳和氮，在線粒體甘氨酸裂解系統(tǒng)的共同作用下，使Gly轉(zhuǎn)化為Ser、CO2及NH3[7]，推測(cè)這可能是SHMT能作為除草劑靶點(diǎn)(造成Gly轉(zhuǎn)化為Ser、CO2及NH3障礙，植物光呼吸受抑制，葉片萎黃或生長(zhǎng)遲緩)的原因所在。結(jié)合白及SHMT的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，該蛋白不具信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)白及與豌豆一樣，SHMT也有線粒體型、葉綠體型和胞質(zhì)型之分，且在同一植株中根、莖、葉中含量也不相同[19]。

本研究通過(guò)對(duì)白及SHMT的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步闡明SHMT的作用機(jī)制及功能應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為植物SHMT基因的分子研究提供了理論依據(jù)和資料。