洪宇航，黃 毅

( 西昌學院 動物科學學院，攀西動物疫病監(jiān)測與防控重點實驗室，四川 西昌 615000 )

作為農業(yè)生產中提升農作物產量的有效手段，農藥的使用至今已有上百年的歷史。傳統(tǒng)的有機磷類和有機氯類農藥由于其較強的生態(tài)危害和對人畜的副作用而逐漸被減少使用[1]。相比之下，擬除蟲菊酯類農藥由于其高光穩(wěn)定性、高降解、低殘留以及對哺乳動物低毒等特點而在世界范圍內被廣泛使用[2]。溴氰菊酯化學名稱為 (1R)-順式-2,2-二甲基-3-(2,2-二溴乙烯基)環(huán)丙烷羧酸-(S)-a-氰基-3-苯氧基芐酯，分子式:C22H19Br2NO3，分子量:505.21，純品為白色斜方形針狀晶體，常溫下幾乎不溶于水，溶于丙酮及二甲苯等大多數芳香族，是農藥敵殺死的主要成分，為常用擬除蟲菊酯類農藥之一[3]。其主要通過產生DNA雙鏈、單鏈斷裂以及姐妹染色單體交換等現象對各種動物血細胞、骨髓細胞、肝、腸等組織和細胞產生遺傳毒性[4-5]。由于它具有高效、廣譜、殘留少等特點，被廣泛應用于各種農作物蟲害防治[6]。近年來，隨著工業(yè)發(fā)展及水產養(yǎng)殖產業(yè)的擴大，溴氰菊酯也被大量用于漁業(yè)生產活動，如蝦池、灘涂養(yǎng)殖池塘的清塘或毒殺敵害生物等[7]。因此，溴氰菊酯對水生動物的毒性作用成為水產養(yǎng)殖和環(huán)境生態(tài)領域的熱點之一。但是，關于溴氰菊酯對水生生物的毒性研究目前主要集中在魚類、貝類以及小型甲殼動物，而對于蝦蟹類則鮮有報道[8]。

中華絨螯蟹(Eriochiersinensis)是我國本土重要的經濟水產品種，年產量超過8×105t，產值超過300億元。其中，稻蟹混合養(yǎng)殖模式是河蟹養(yǎng)殖中重要的生產模式之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，其質量安全問題越來越受到消費者的關注。而生產中溴氰菊酯的使用，特別是稻蟹養(yǎng)殖區(qū)域內溴氰菊酯的直接或間接使用，會對中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖產生潛在威脅。目前關于溴氰菊酯對中華絨螯蟹毒性作用的研究已有一例報道，在質量濃度為5.00 μg/L藥液中，約3 h中華絨螯蟹很快活力減弱，表現出四肢無力或顫抖的癥狀，個別個體附肢脫落，最后全部死亡。在較低含量如0.5 μg/L藥液中，中華絨螯蟹死亡時間明顯延長，部分中華絨螯蟹還能逐步恢復活力。但其結果僅探討了溴氰菊酯對不同生長階段中華絨螯蟹的急性毒性，并未進一步研究對中華絨螯蟹的遺傳毒性作用[9]。

彗星檢測又稱單細胞凝膠電泳，通過電泳后DNA的拖尾長度定量檢測細胞中的DNA損傷程度，是評價外源因子對目標生物基因毒性的重要指標[10]。彗星檢測作為評價毒物遺傳毒性的重要工具，自1978年開發(fā)以來被廣泛使用于各領域，包括遺傳毒理、環(huán)境監(jiān)測等。其在個體暴露于空氣污染物、金屬、農藥、輻射等有害異物的損傷評價中有良好的指示作用[11]。近年來，在水生環(huán)境監(jiān)測中有較多的應用。有報道指出，彗星檢測較其他常用的遺傳生態(tài)毒理學生物指標有更好的敏感性[12]。目前，彗星檢測在外源毒物對水生動物的基因毒性檢測中已有多例報道，但主要集中在海洋魚類、貝類及小型甲殼類，而針對淡水甲殼類的研究較少[13-15]，僅有小型甲殼類如大型溞(Daphniamagna)[16]和鉤蝦(Gammarusfossarum)[17]的報道。因此，本試驗參考溴氰菊酯對中華絨螯蟹的毒性結果及在生產中的水體殘留狀況，通過對中華絨螯蟹進行不同劑量溴氰菊酯暴露，并利用彗星檢測技術探究其對免疫功能主要執(zhí)行者——血細胞的DNA損傷情況，為進一步研究菊酯類農藥對中華絨螯蟹的毒理機制奠定基礎，為菊酯類農藥在淡水經濟甲殼類動物中的毒性評價體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及藥品

試驗用中華絨螯蟹采自江蘇省金壇市水產技術推廣站中華絨螯蟹標準化養(yǎng)殖場，試驗前循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d以上。挑選健康無病、規(guī)格均等的中華絨螯蟹雌雄各半用于試驗，平均體質量(14.5±3.2) g。溴氰菊酯乳劑購自德國拜耳作物科學有限公司，有效含量25 g/L。溶劑丙酮購自成都科龍化工試劑廠，分析純。

1.2 試驗設計

溴氰菊酯乳劑加入丙酮配制成25 μg/L儲備液待用。參考溴氰菊酯在中華絨螯蟹毒性試驗中的安全質量濃度和96 h半致死質量濃度[9]，以及生產中溴氰菊酯在養(yǎng)殖水體中的殘留量[18]，設置0.10、0.20、0.40 μg/L 3個質量濃度組，0 g/L的空白對照組以及只添加丙酮的溶劑對照組。每組中華絨螯蟹30只，設置3個平行，每個125 cm×60 cm×60 cm水族箱中隨機放入10只中華絨螯蟹，加入經充分曝氣的自來水50 L，并在箱底放置經消毒處理的聚氯乙烯瓦片作為遮蔽物。試驗采用半靜水法，日換水一次，提前配置相同含量溴氰菊酯溶液以保證試驗含量不變。光暗周期12 h∶12 h，試驗期間每日8:00和19:00投喂人工配合飼料，并于投喂后3 h清除殘餌和排泄物。試驗期間每日測量水溫和水質指標，保證水溫(20±2) ℃，pH 7.2～7.8, 溶解氧>5 mg/L，氨氮<0.5 mg/L, 亞硝酸鹽<0.15 mg/L。分別于1、2、4、8、12 d觀察中華絨螯蟹存活情況，每組任意選取3只收集血細胞用于彗星檢測。

1.3 細胞懸液的制備

每個采樣時間點獲得中華絨螯蟹后立即進行抗凝血采集。1 mL無菌注射器從第五步足基部基膜處采血，血淋巴與4 ℃預冷的抗凝劑(檸檬酸三鈉 4.41 g，NaCl 9.88 g，葡萄糖11.39 g，EDTA 1.46 g，蒸餾水 500 mL)1∶1混合均勻。采集的抗凝血立即于4 ℃、1000 r/min條件下離心5 min，去上清液得到血細胞沉淀。蟹生理鹽水(NaCl 14.5 g，KCl 0.355 g， CaCl20.899 g，MgSO4·7H2O 1.58 g，NaHCO30.25 g，MgCl2·6H2O 0.85 g，HEPES 2.38 g，蒸餾水500 mL)清洗一次，再加入1 mL蟹生理鹽水均勻吹打形成血細胞懸液。臺盼藍拒染法測定血細胞活性，確保血細胞存活率大于90%用于后續(xù)試驗。調整細胞密度至1×106個/mL 待用。

1.4 彗星試驗方法

彗星試驗方法根據文獻[17]的方法進行改良，分別配制0.8%正常熔點瓊脂糖及1%低熔點瓊脂糖放置于恒溫混勻器(Thermo，美國)中保溫待用。

1.4.1 制片

取100 μL 0.8%正常熔點瓊脂糖滴至單面磨砂載玻片磨砂面，蓋上蓋玻片并迅速放入4 ℃冰箱冷卻10 min。將鋪有第一層凝膠的載玻片取出后，移去蓋玻片，在第一層膠上平鋪混勻的含25 μL細胞懸液和50 μL 1%低熔點瓊脂糖的混合液，蓋上蓋玻片后立即4 ℃放置10 min進行冷卻凝固。將載玻片取出后移去蓋玻片，在第二層凝膠上平鋪1%低熔點瓊脂糖100 μL，蓋上蓋玻片4 ℃放置30 min。

1.4.2 裂解

移去蓋玻片，將載玻片浸入新鮮配制的細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris-HCl， pH 10，用前加入10%Triton X-100，10%DMSO)中4 ℃裂解40 min。

1.4.3 電泳

將載玻片取出后用PBS漂洗2次，在電泳槽中倒入堿性電泳液(300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA, pH 13)，約超過載玻片0.25 cm，25 V, 200 mA條件下電泳30 min。

1.4.4 中和及染色

電泳完畢后，PBS漂洗2次。用預冷的中和液(0.4 mol/L Tris-HCl, pH 7.5)中和3次，每次5 min。之后每張載玻片滴加20 μL碘化丙啶染液，避光染色10 min。

1.4.5 觀察并計數

染色結束后在倒置熒光顯微鏡(Leica DMi8，德國)下進行觀察并拍照。每張載玻片隨機觀察10個視野，CASP 軟件對彗星圖像進行分析。

拖尾率/%=拖尾細胞數/視野細胞總數

Olive尾矩=彗星細胞尾長×尾部DNA含量

1.5 數據分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，用Levene法進行方差齊性檢驗，不滿足齊性方差時對數據進行反正弦或者平方根處理，采用ANOVA對試驗結果進行方差分析，LSD和Duncan 法進行多重比較，取P<0.05為差異顯著，P<0.01為極顯著，在GraphPad Prism 5軟件上繪制相關圖表。不同質量濃度溴氰菊酯暴露下Olive尾距與暴露時間的回歸曲線通過Excel 軟件計算并繪制。

2 結 果

空白對照組和溶劑對照組血細胞染色后呈圓形熒光團，DNA結構較為緊密(圖1a,b)。而其余各組均出現不同程度的細胞拖尾現象，如形成較短彗尾的輕度拖尾，形成較長彗尾的中度拖尾以及形成掃帚狀，拖尾最長的重度拖尾。且隨著試驗質量濃度增加，拖尾現象越加明顯，表明DNA受損程度越深(圖1c～e)。

圖1 不同含量溴氰菊酯暴露下中華絨螯蟹血細胞損傷的彗星圖像a：空白對照組；b：溶劑對照組；c：0.10 μg/L組；d：0.20 μg/L組；e：0.40 μg/L組.

試驗結果顯示，對照組各時間點拖尾率約為5%，受損細胞極少。溶劑組各時間點拖尾率及Olive尾距同對照組均差異不顯著(P>0.05)，表明溶劑丙酮并非導致中華絨螯蟹血細胞DNA損傷的原因。由圖2可知，在0.20 μg/L和0.40 μg/L質量濃度下，早在1 d即出現一定程度的拖尾現象，其血細胞拖尾率顯著高于對照組(P<0.05)，其中0.20 μg/L組極顯著高于對照組(P<0.01)。隨著溴氰菊酯含量的增加，在此后各時間點各組拖尾率均呈逐漸增高的趨勢，表現出明顯的劑量效應；此外，隨著暴露時間的增加，各試驗組血細胞拖尾率較先前也呈上升趨勢，均極顯著高于對照組(P<0.01)，具有明顯的時間效應。至12 d時，0.10 μg/L組拖尾率已高達(61.68±6.21)%，多數細胞出現嚴重拖尾現象。

不同質量濃度溴氰菊酯暴露下各時間點中華絨螯蟹血細胞彗星Olive尾距見圖3，其中對照組和溶劑組Olive 尾距極低，特別是對照組幾乎接近于0，表明對照組和溶劑組中血細胞DNA并未發(fā)生斷裂或斷裂極少，而其余各組均極顯著高于對照組，證明血細胞DNA有明顯斷裂。Olive尾距變化趨勢同拖尾率相同，也具有劑量—時間效應。不同劑量溴氰菊酯下Olive 尾距與暴露時間的回歸分析表明，0.20 μg/L組Olive 尾距與暴露時間有較好的線性關系，相關系數為0.8148；而0.10 μg/L組與0.40 μg/L組Olive尾距與暴露時間相關性較差，相關系數分別為0.6902和0.7029(圖4)。

圖2 不同含量溴氰菊酯暴露下彗星檢測拖尾率變化*為差異顯著(P<0.05)，**為差異極顯著(P<0.01),下同.

圖3 不同含量溴氰菊酯暴露下彗星檢測Olive尾距變化

圖4 不同含量溴氰菊酯暴露下Olive尾距與暴露時間的回歸曲線

3 討 論

關于溴氰菊酯對水生生物的研究，目前國內外有很多報道，但主要集中在魚類，而鮮見關于甲殼動物的報道。姜輝等[19]總結菊酯類農藥對水田生物的影響認為，大多數菊酯類農藥對魚類的96 h 半致死質量濃度要比蝦類高1～2個數量級。因此，生產中存在利用低含量溴氰菊酯作為治療魚類寄生蟲病，并用于殺滅魚塘中甲殼類的情況[20]。大量使用的溴氰菊酯隨著農田排水或雨水沖淋，對中華絨螯蟹以及其他經濟甲殼類養(yǎng)殖水體產生較大安全影響。耿雪冰[9]通過對不同規(guī)格中華絨螯蟹進行溴氰菊酯急性毒性試驗，得出溴氰菊酯對中華絨螯蟹成蟹和幼蟹的48 h 半致死質量濃度分別為0.65、0.42 μg/L，安全質量濃度分別為0.46、0.19 μg/L，屬于高毒農藥。但其并未進一步研究溴氰菊酯對于中華絨螯蟹生理及免疫，特別是遺傳毒理方面的影響。由于本試驗所用中華絨螯蟹規(guī)格為(14.5±3.2) g，與上述研究中所用中華絨螯蟹幼蟹規(guī)格(17.9±1.9) g相近，且在預試驗中0.65 μg/L溴氰菊酯質量濃度下中華絨螯蟹96 h 死亡率超過80%，因此選取接近其96 h半致死質量濃度的0.40 μg/L溴氰菊酯作為最高質量濃度，低于其安全質量濃度的0.10 μg/L作為最低質量濃度，旨在探討亞致死質量濃度條件及安全質量濃度下溴氰菊酯對中華絨螯蟹的遺傳毒性作用。

彗星試驗分析指標眾多，包括拖尾率、尾長、彗尾DNA含量、尾距及Olive尾距等。拖尾率作為最早使用的指標，可以方便、直觀地體現毒物對標靶生物的遺傳毒性大小。但由于其具有一定主觀性，因此在后來的研究中又加入了尾距及Olive尾距復合指標，可以更加全面地對毒物的遺傳毒性進行評價[10-11]。本試驗采用拖尾率和Olive尾距兩項指標檢測溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細胞的DNA損傷程度。結果表明，溴氰菊酯可以造成中華絨螯蟹血細胞明顯的DNA損傷，即使是0.10 μg/L最低質量濃度組，在1 d后拖尾率和Olive尾距也顯著高于對照組，表明溴氰菊酯對中華絨螯蟹遺傳毒性較強，且產生毒害作用十分迅速，在1 d內即可造成損傷。蔡道基等[18]通過稻田施用生產用量的溴氰菊酯，并模擬下雨將農田水排入魚塘，測定了池塘水體及底泥中溴氰菊酯的殘留。結果顯示，溴氰菊酯排入池塘中其質量濃度4 h后可達最高峰，平均為0.41 μg/L，隨后迅速降解，14 h后不再檢出。因此，雖然溴氰菊酯在養(yǎng)殖水體中降解較快，但仍可能在短時間內造成中華絨螯蟹血細胞DNA損傷，從而引發(fā)其他的免疫功能缺陷，影響其生長存活。這一結果同多氯聯苯對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[21]的毒性作用的研究結論相似。在0.5 μg/L多氯聯苯暴露下，櫛孔扇貝血細胞在1 d后即出現顯著的拖尾現象。房燕等[22]的研究也表明，在鎘和汞復合脅迫下，即使最低質量濃度也可在1 d后引起四角蛤蜊(Mactraveneriformis)血細胞出現明顯DNA損傷，其Olive尾距顯著高于對照組。本研究還發(fā)現，血細胞拖尾率和Olive尾距在試驗過程中出現明顯的時間效應和劑量效應，至12 d達到峰值，表明溴氰菊酯引起的DNA損傷隨著暴露時間的增加而愈加嚴重，且在短時間內難以恢復。良好的時間和劑量同DNA損傷的相關性也表明拖尾率和Olive尾距這兩個指標可以作為敏感的生物標志物在溴氰菊酯遺傳毒性檢測中應用。這同Nwani等[23]在農藥草甘膦對翠鱧(Channapunctatus)的毒性研究中得到的結果相似，草甘膦暴露引起的血細胞DNA損傷存在明顯的時間劑量效應，隨著藥物含量升高和暴露時間延長，DNA損傷加重。

此外，Olive尾距與暴露時間回歸分析表明，0.20 μg/L組線性關系較好，而0.10 μg/L組線性關系最差。有研究指出，低含量毒物條件下機體DNA損傷后修復能力強于高含量條件[24]。本研究結果也證實了該結論。在低質量濃度條件下，中華絨螯蟹血細胞DNA修復能力更強，從而隨著試驗時間的推移其損傷程度和暴露時間之間的線性相關性降低。高含量多氯聯苯下櫛孔扇貝血細胞損傷較低含量有更強的恢復，推斷高含量污染物可以愈發(fā)地激發(fā)機體DNA的自我修復[21]。這可能是本試驗中0.40 μg/L組Olive尾距與時間的線性關系低于0.20 μg/L組的原因。

溴氰菊酯在農業(yè)、漁業(yè)生產中被大量使用后，直接或間接進入養(yǎng)殖水體。由于生產過程中施藥劑量較低，降解迅速，且經試驗觀察發(fā)現，低于安全質量濃度溴氰菊酯暴露下，中華絨螯蟹不會出現明顯的應激行為和死亡現象，因此在生產過程中其對中華絨螯蟹的毒性影響易被忽視。但經本試驗證實，溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細胞有較強的遺傳毒性，即使在較低的安全質量濃度下也可以在1 d內造成其血細胞DNA出現損傷，因此筆者建議在生產中養(yǎng)殖水體及附近應避免使用。彗星檢測可以有效地對溴氰菊酯在中華絨螯蟹遺傳毒性作用中進行評估，拖尾率和Olive尾距是可以在檢測中使用的較為敏感的生物標記。本研究將為后續(xù)菊酯類農藥在淡水水生動物毒性作用的評估及環(huán)境毒理檢測提供理論依據。