臧凱麗，江 巖，孫 勇，閆亞麗,，陳慶森，趙林森，趙 培，崔文靜，馬新穎

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.北京食品科學(xué)研究院，中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

腸道既是人體的消化場(chǎng)所又是人體最大的免疫器官，富集著龐大而復(fù)雜的微生物群落，約有800余種7 000多株的細(xì)菌，在亞種或菌株水平上表現(xiàn)出極大的多樣性[1]。腸道微生物對(duì)人類健康有著重要的影響，能夠幫助宿主代謝，為腸道上皮細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)免疫功能，抵抗外來微生物的入侵[2]。正常狀態(tài)下，腸道微生物與宿主間存在著復(fù)雜而微妙的動(dòng)態(tài)平衡，微生物從宿主汲取生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，宿主則借助微生物來降解一些自身不能分解利用的物質(zhì)[3]。腸道微生物與宿主之間的平衡一旦被打破，就會(huì)造成腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，腸道微生物就會(huì)從能量吸收、內(nèi)毒素血癥、短鏈脂肪酸、膽堿、膽汁酸代謝和腦腸軸等多種途徑影響宿主的健康[4]。腸道菌群之所以被稱為人類的“第二指紋”，是由于每個(gè)個(gè)體都有自己獨(dú)特的腸道微生物組，其組成和功能通常會(huì)隨著宿主的基因、飲食及環(huán)境等因素的變化而改變[5]。早在20世紀(jì)90年代初，Metchnikoff就提出了著名的“梅氏假說”，發(fā)現(xiàn)保加利亞人長(zhǎng)壽的秘訣在于其長(zhǎng)期飲用發(fā)酵乳[6]。近些年來，由于益生菌能夠直接或者間接地調(diào)整宿主腸道微生物的組成、增加有益菌的比例，激活宿主內(nèi)源性微生物或者免疫系統(tǒng)的活性，被廣泛用于預(yù)防和治療許多腸道疾病，尤其針對(duì)腹瀉、便秘及腸易激綜合征等病癥。目前研究較多的益生菌主要包括乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌等。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌三聯(lián)劑Bio-Three具有提高治療腹瀉療效，縮短病程等效果；Heo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）能夠通過抑制相關(guān)病原菌生長(zhǎng)，安全有效地治療各種腹瀉和腸道內(nèi)異常發(fā)酵。Guandalini等[9]通過對(duì)受試人群每天服用混合8 種凍干菌劑的研究發(fā)現(xiàn)，混合凍干菌劑顯著地改善了腸易激綜合征的病癥；丁圣等[10]通過對(duì)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌和低聚果糖對(duì)腸道內(nèi)的腸桿菌、腸球菌等有害菌有抑制作用，對(duì)雙歧桿菌等腸道有益菌具有增殖作用。雖然益生菌劑的相關(guān)研究頗多，但大多以其作用機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)研究其對(duì)腸道微生物多樣性以及菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，關(guān)于具體菌群豐度的調(diào)節(jié)作用的報(bào)道較少。

隨著該領(lǐng)域研究的深入，宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)的Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序技術(shù)發(fā)展到第二代高通量測(cè)序，目前基于16S rRNA基因可變區(qū)高通量測(cè)序的技術(shù)應(yīng)用較多的有Roche454、Illumina的HiSeq及MiSeq、Life的Ion Torrent高通量測(cè)序技術(shù)[11]，這些技術(shù)為解析腸道菌群豐度的變化與人類健康的關(guān)系做出了貢獻(xiàn)。

鑒于前人對(duì)益生元、益生菌及合生元等益生特性的研究[12]，本研究采用對(duì)便秘、腹瀉等腸道疾病有明顯調(diào)節(jié)作用的菊粉、水蘇糖、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、兩歧雙歧桿菌等成分復(fù)合制備而成的益生菌劑對(duì)不同健康狀態(tài)的受試人群加以干預(yù)，從調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)豐度水平、提高菌群多樣性和改善腸道微生物與宿主平衡的角度出發(fā)，分析益生菌劑對(duì)腸道相關(guān)疾病的作用，為以腸道微生物為靶點(diǎn)的腸道疾病的預(yù)防提供理論依據(jù)，并提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益生菌劑：抗性糊精（15%～20%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、菊粉（10%～15%）、水蘇糖（5%～10%）、麥芽糊精（10%～15%）、植物乳桿菌LP45（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌La28（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌YMC1069（Lactobacillus casei）、兩歧雙歧桿菌TMC3115（Bifidobacterium bifidum），活菌數(shù)比例為1∶1∶1∶1，活菌數(shù)2×1010CFU/g，由河北一然生物科技有限公司提供。

Ion Xpress? Barcode Adapters Kit、Ion PGM?Template OT2 200 Kit、Ion PGM? Sequencing 200 Kit v2、Ion Plus Fragment Library Kit、Ion Library TaqMan?Quantitation Kit、Pfu DNA聚合酶 美國(guó)Thermo Scientific公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit 美國(guó)Invitrogen公司；High Sensitivity DNA Kit 美國(guó)Agilent公司；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 德國(guó)QIAGEN公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K18高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；508-U001 Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)、2.0 Qubit熒光定量?jī)x 美國(guó)Invitrogen公司；Ion One TouchTM2INS（模板制備系統(tǒng)）、Ion One Touch?ES（模板富集系統(tǒng)）、磁力架 美國(guó)Thermo Scientific公司；2100生化分析儀 美國(guó)Agilent公司；GeneAmp 7900聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國(guó)ABI公司；II-3 Biowave DNA紫外-可見分光光度計(jì) 英國(guó)柏諾公司。

1.3 方法

1.3.1 受試人群健康特征描述

受試人群年齡為18～35 歲。健康、便秘、腹瀉志愿者的臨床癥狀確定：通過對(duì)受試者的詢問及其自身表述，按照臨床醫(yī)學(xué)給定的便秘、腹瀉以及健康個(gè)體的臨床癥狀確定；要求志愿者在開始實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)星期內(nèi)未發(fā)生任何疾??；實(shí)驗(yàn)期間無使用抗生素等藥物或接受治療的情況，同時(shí)不限制受試人群每日飲食內(nèi)容及時(shí)間；另外，還要求受試者3 個(gè)月內(nèi)未參與其他實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 受試人群的分組及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)從38 名志愿受試人群中[13]，深度挖掘益生菌劑對(duì)不同疾病個(gè)體腸道菌群多樣性以及豐度水平的變化，故在已有樣本的條件下，選擇男性5 名，女性12 名。受試人群保持飲食及睡眠正常且無限制，每日服用益生菌劑，早晚各一次，2 g/次（活菌數(shù)約2×1010CFU/g）；干預(yù)期間記錄飲酒、服藥等特殊情況。服用益生菌劑前統(tǒng)一采集糞便1 次，干預(yù)期間每周采集2 次，共6 周，停止服用2 周后，采集2 次，并將其統(tǒng)一放置于液氮罐中保存，共采集糞便樣品180 個(gè)。用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取糞便細(xì)菌基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，又根據(jù)細(xì)菌基因組完整性以及濃度等判斷，約有104 個(gè)樣本符合要求，保存?zhèn)溆?。最后選擇健康（1男2女）、便秘（2女）、腹瀉（1男2女）、排便不規(guī)（1男）、腸易激綜合征（1男）、腹脹（1女）等不同生理狀態(tài)11 人共69 個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，按健康狀況將樣品依次分為健康對(duì)照組（CT）、便秘組（CO）、腹瀉組（DI）及其他組（OT）共4 組。

1.3.3 腸道菌群16S rRNA V3區(qū)的高通量測(cè)序

首先，進(jìn)行糞便中微生物總DNA的提取，然后對(duì)腸道菌群16S rRNA V3區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，通過Ion Torrent PGM進(jìn)行測(cè)序[13]。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先，用FastQC將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，并利用NGStool kits過濾掉低質(zhì)量序列。將質(zhì)控得到的高質(zhì)量序列根據(jù)樣品Barcode和引物進(jìn)行數(shù)據(jù)的正、反方向分選，進(jìn)入微生物生態(tài)學(xué)定量研究（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）后再次進(jìn)行質(zhì)控以及去除嵌合體，利用usearch方法在97%的相似水平下劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）；選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列為代表序列，再參照樣品的信息，生成以序列數(shù)代表的每個(gè)樣本中每個(gè)OTU豐度的OTU Table。然后，以O(shè)TU Table為基礎(chǔ)按照進(jìn)行物種分類，生成系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)樣品各水平相對(duì)豐度進(jìn)行劃分；依據(jù)OTU Table數(shù)據(jù)進(jìn)行每個(gè)文庫多樣性分析，并利用R軟件（Version 3.4.2）繪制稀釋曲線、Rank-Abundance曲線、Chao1指數(shù)箱線圖以及Shannon指數(shù)箱線圖。最后，為了減少因某些樣本中含有豐度極高的OTU而造成的樣本間距離分布異常和測(cè)序時(shí)帶來的偏差，研究中對(duì)所有樣本中的OTU豐度進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)即樣品中各進(jìn)化水平相對(duì)豐度百分比用Stamp軟件尋找差異OTU，并用R軟件（Version 3.4.2）繪制后續(xù)的熱圖、堆砌條圖以及實(shí)現(xiàn)降維的主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌劑對(duì)腸道微生物多樣性的影響分析

2.1.1 多樣性指數(shù)分析

圖1 樣品多樣性指數(shù)分析Fig. 1 Analysis of microbial diversity index

由圖1a可知，隨著樣品測(cè)序深度的增加，觀測(cè)物種指數(shù)曲線趨于平緩，說明當(dāng)前測(cè)序深度足以發(fā)現(xiàn)各樣本生境中的大部分物種。此外，從圖1b中反映物種豐富度及均勻度的Rank-Abundance曲線可以看出，隨著OTU等級(jí)的增加，曲線愈加平坦并且在橫軸的跨度也越來越大，說明樣品中物種的均勻度和相對(duì)豐度都達(dá)到了很高的水平。

2.1.2 益生菌劑干預(yù)下的腸道菌群多樣性的變化

圖2 益生菌劑干預(yù)下腸道菌群α多樣性的變化Fig. 2 Changes in α diversity of intestinal flora with the intervention of probiotics

圖2 a、b分別反映受試人群腸道菌群物種豐富度和微生物多樣性，與CT組相比，3 組不同健康狀態(tài)的受試人群腸道菌群的物種豐富度在益生菌劑干預(yù)后都有不同程度的增加，并且都向CT組靠近，說明益生菌劑干預(yù)對(duì)不同健康狀態(tài)人群腸道菌群的多樣性具有一定影響。

2.2 益生菌劑對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

以97%的相似水平通過usearch劃分OTU進(jìn)化水平，在門水平上選取樣品中最大豐度排名前十的物種劃分為10 個(gè)菌門，結(jié)果如圖3所示。

圖3 益生菌制劑對(duì)腸道菌群門水平上相對(duì)豐度的影響Fig. 3 Effect of probiotics on relative abundance of dominant phyla

圖3顯示所有OTU被劃分為10 個(gè)門，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）為各組受試人群腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門，占總序列數(shù)的99.81%，其中Bacteroidetes的含量最豐富，約占總序列數(shù)的80.30%，其次是Firmicutes，約占總序列數(shù)的13.14%，而Proteobacteria和Actinobacteria的占比分別為4.14%、1.98%。其余的如藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、TM7、疣微菌門（Verrucomicrobia）及無壁菌門（Tenericutes）在各樣品中所占比例不足0.1%，另外，還有約0.01%左右的細(xì)菌（Unclassified）無法確定具體分類地位。

從圖3可以看出，不同健康狀況的受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)中門水平相對(duì)豐度的差異較明顯，從便秘組看，受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)中Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria這3 種優(yōu)勢(shì)菌門有一個(gè)共同特點(diǎn)：在干預(yù)4 周后的菌群相對(duì)豐度分別為80.07%、12.48%、7.27%，與健康對(duì)照組（79.32%、13.75%、6.63%）最為接近，不同的是，Bacteroidetes的相對(duì)豐度隨著益生菌劑的干預(yù)逐漸降低，由最初的84.27%降到44.78%；Firmicutes相對(duì)豐度在益生菌劑干預(yù)階段雖略有波動(dòng)，但是總體呈上升趨勢(shì)；Proteobacteria相對(duì)豐度隨益生菌劑干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降低后升高起伏波動(dòng)狀態(tài)。此外，Cyanobacteria和Fusobacteria的相對(duì)豐度與健康對(duì)照組（0.08%、0.005%）具有一定差異，但是，在益生菌劑干預(yù)第4周均從零上升到0.001 7%，不過在益生菌劑停止干預(yù)后又恢復(fù)到了干預(yù)前的狀態(tài)。對(duì)于腹瀉組受試人群來說，益生菌劑對(duì)Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria有積極的調(diào)整作用，除Proteobacteria在干預(yù)4 周后由最初的3.08%調(diào)整到6.87%，與對(duì)照組（6.63%）最為接近外，其余兩種均在干預(yù)停止后保持與對(duì)照組接近的84.17%、8.06%狀態(tài)，同時(shí)，F(xiàn)usobacteria在停止干預(yù)后異常升高至0.39%，遠(yuǎn)超對(duì)照組（0.005%）。就其他健康狀況的受試人群來說，Bacteroidetes和Firmicutes在干預(yù)第4周分別調(diào)整到80.05%、14.65%，Proteobacteria和Actinobacteria在干預(yù)3周前分別由1.12%、0.03%升至4.94%、0.29%，與對(duì)照組（6.63%、0.21%）最為接近，但是，在停止干預(yù)后，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria并沒有保持不變而是呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

此外，對(duì)排名前20的各個(gè)菌科在益生菌劑干預(yù)下的各個(gè)樣品中相對(duì)豐度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes的毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、韋榮球菌科（Veillonellaceae）、梭菌科（Clostridiaceae），Bacteroidetes的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae），Proteobacteria的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）、弧菌科（Desulfovibrionaceae），以及Actinobacteria的雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）在科的水平上相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)地位。

圖4 益生菌制劑對(duì)腸道菌群科水平上相對(duì)豐度的影響Fig. 4 Effect of probiotics on relative abundance of dominant families

從圖4中可以看出，受試人群在益生菌劑的干預(yù)下，便秘組的Prevotellaceae、Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）及S24-7相對(duì)豐度在干預(yù)第4周后分別由0.23%、4.43%、2.58%、0.005%、0.03%增加至46.47%、6.50%、3.45%、0.1%、0.8%，停止干預(yù)后又降至22.01%、5.09%、3.28%、0.06%、0.29%；Bacteroidaceae、Desulfovibrionaceae和Rikenellaceae相對(duì)豐度分別由76.97%、0.085%、1.85%降至20.65%、0.023%、0.72%，停止干預(yù)后又升至50.75%、0.11%、0.83%。其中，Alcaligenaceae、Rikenellaceae、Coriobacteriaceae在向?qū)φ战M（4.22%、0.58%、0.088%）靠近。腹瀉組中，受試人群中Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae的菌群相對(duì)豐度從開始干預(yù)到第4周分別由1.87%、1.73%、0.12%、0.15%、0.05%、0.07%增至4.39%、4.46%、8.65%、0.55%、0.18%、0.23%；而Veillonellaceae經(jīng)益生菌劑干預(yù)后由3.06%降至2.16%。其中，Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、Erysipelotrichaceae、Veillonellaceae向?qū)φ战M（5.49%、4.22%、0.24%、2.20%）狀態(tài)調(diào)整，并且，Lachnospiraceae在干預(yù)停止后不會(huì)恢復(fù)至干預(yù)前的狀態(tài)，仍保持在4.70%左右。就其他組受試患者菌群結(jié)構(gòu)而言，在益生菌劑的作用下，除Veillonellaceae有下降的趨勢(shì)外，Erysipelotrichaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Coriobacteriaceae、S24-7都呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中，Enterobacteriaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae分別從干預(yù)前的0.19%、0.003 3%、0.32%、0.23%、0.17%提升至1.50%、0.19%、0.59%、0.38%、0.20%，接近于對(duì)照組相對(duì)豐度（1.49%、0.12%、0.58%、0.44%、0.28%）。

2.3 關(guān)鍵菌屬的鑒定

根據(jù)上述腸道微生物整體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，各疾病狀態(tài)受試人群的腸道微生物多樣性與對(duì)照組具有一定程度的差異，益生菌劑的干預(yù)使得其菌群結(jié)構(gòu)的組成發(fā)生了改變，為了尋找益生菌劑干預(yù)前后造成腸道微生物多樣性差異的關(guān)鍵菌屬，進(jìn)一步在屬水平上進(jìn)行Welch’s t-test檢驗(yàn)顯著性差異，進(jìn)而進(jìn)行Stamp分析，發(fā)現(xiàn)3 組受試人群的腸道微生物經(jīng)益生菌劑干預(yù)后在屬水平均有顯著不同，結(jié)果如圖5所示。

圖5 腸道菌群中關(guān)鍵菌屬的變化Fig. 5 Change of key bacterial genus in intestinal flora

從圖5中可以看出，3 組受試人群在益生菌劑干預(yù)下共有20 個(gè)關(guān)鍵菌屬存在顯著差異（P＜0.05），其中，便秘組有5 個(gè)，包括擬桿菌屬（Bacteroides）、柯林斯菌屬（Collinsella）、巨單胞菌屬（Megamonas）、Odoribacter、普氏菌屬（Prevotella）；腹瀉組有柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、布勞特氏菌屬（Blautia）、梭菌屬（Clostridium）、小類桿菌屬（Dialister）、埃格特菌屬（Eggerthella）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、草酸桿菌屬（Oxalobacter）、Pyramidobacter等10 個(gè)，其他組有5 個(gè)，即Adlercreutzia、Collinsella、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）、Parabacteroides和薩特氏菌屬（Sutterella）。

2.4 關(guān)鍵菌屬對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

為了探究關(guān)鍵菌屬對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響，通過Stamp分析尋找到20 個(gè)關(guān)鍵菌屬，基于20 個(gè)關(guān)鍵菌屬進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 PCA分析Fig. 6 PCA analysis

圖6 顯示，3 組不同健康狀態(tài)樣品均與健康對(duì)照組呈現(xiàn)交疊的狀態(tài)，各組樣品并不能完全分開，說明相較其他因素，益生菌劑對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用較為明顯。并且，3 組樣品在X軸上的距離比較長(zhǎng)。隨著益生菌劑干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，便秘組關(guān)鍵菌屬由最初接近健康對(duì)照組逐漸沿著PC1（貢獻(xiàn)率91.26%）、PC2（貢獻(xiàn)率7.14%）拉開距離，在PC2方向尤為明顯，但是距離健康對(duì)照組越來越遠(yuǎn)；腹瀉組菌屬則在益生菌劑干預(yù)第5周直至停止干預(yù)后沿PC1逐漸向?qū)φ战M接近；其他組菌屬在益生菌劑干預(yù)期間向健康對(duì)照組靠近，在停止干預(yù)后并沒有繼續(xù)保持這種狀態(tài)。在PCA圖中，各組樣品隨著益生菌劑干預(yù)的時(shí)長(zhǎng)呈現(xiàn)調(diào)整狀態(tài)，正是這種差異顯著的狀態(tài)，從另一層面上說明這20 個(gè)菌屬可能是造成疾病組與健康對(duì)照組受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵菌屬。

2.5 關(guān)鍵菌屬菌群相對(duì)豐度的變化

將Welch’s t-test檢驗(yàn)出的存在顯著差異的20 種菌進(jìn)行了相對(duì)豐度柱狀圖的繪制，如圖7顯示，在益生菌劑的干預(yù)下，便秘組Bacteroides、Prevotella、Parabacteroides的變化明顯且迅速，在干預(yù)第1周開始分別由最初的76.98%、0.23%、3.69%調(diào)整至22.18%、35.13%、18.7%，Megamonas由最初的0.005%逐漸向健康對(duì)照組（0.91%）調(diào)整，在第3周時(shí)達(dá)到1.06%，與對(duì)照組最為接近，Collinsella也在干預(yù)第3周開始出現(xiàn)；腹瀉組Lactobacillus和Clostridium從無到有，并且，Clostridium在第1周就達(dá)到了0.06%，與健康對(duì)照組的相對(duì)豐度相同，Lactobacillus在第4周時(shí)達(dá)到0.006 7%，與健康對(duì)照組（0.007 5%）最為接近；此外，益生菌劑具有升高Blautia降低Dialister和Faecalibacterium的作用，其中，Blautia由最初的0.003 3%升至0.05%，并且，干預(yù)停止后并沒有恢復(fù)至干預(yù)前的狀態(tài)；就其他組而言，益生菌劑對(duì)5 種關(guān)鍵菌屬具有升高的作用，Adlercreutzia在干預(yù)第1周從無到有，升高了0.005%，Collinsella、Klebsiella、Parabacteroides和Sutterella從干預(yù)開始至停止干預(yù)一直處于升高的趨勢(shì)。

圖7 益生菌制劑對(duì)腸道菌群屬水平上相對(duì)豐度的影響Fig. 7 Effect of probiotics on relative abundance of dominant genus

圖8 物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig. 8 Species abundance from clustering heatmap

2.6 益生菌劑對(duì)關(guān)鍵物種的影響

為探究益生菌劑對(duì)腸道微生物種水平的影響，對(duì)其相對(duì)豐度進(jìn)行聚類，得相對(duì)豐度聚類熱圖，圖8展示了物種間的相似性和相對(duì)豐度以及樣本間的相似性。

從圖8可以看出，受試樣品多以Bacteroides為核心菌屬，說明腸型之說的存在。經(jīng)益生菌劑干預(yù)，便秘組受試人群腸道中，玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）在干預(yù)第3周相對(duì)豐度達(dá)到最高（0.02%），超過健康對(duì)照組（0.01%）。Akkermansia muciniphila和兩形真桿菌（Eubacterium biforme）在干預(yù)停止后的第2周相對(duì)豐度最高（0.42%、0.02%），脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）、柔嫩梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）的相對(duì)豐度在第7周（16.17%、1.95%）及干預(yù)停止的第2周（11.6%、2.99%）較高，活潑瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）在干預(yù)第4周及干預(yù)停止的第2周相對(duì)豐度升高，由最初的0.02%增至0.04%、0.08%；此外，卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）和Prevotella stercorea在干預(yù)前相對(duì)豐度最高，這說明益生菌劑具有降低二者相對(duì)豐度的作用。在腹瀉組受試人群腸道菌群中，長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）和糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）在干預(yù)第6周（9.09%、0.33%）相對(duì)豐度最高，Actinobacillus parahaemolyticus和副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）在干預(yù)第1周（0.12%、0.07%）時(shí)相對(duì)豐度增加明顯，Anoxybacillus kestanbolensis的相對(duì)豐度由最初不存在到第4周（0.07%）最高，短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、Blautia producta及細(xì)長(zhǎng)真桿菌（Eubacterium dolichum）都由最初不存在到停止干預(yù)后相對(duì)豐度達(dá)到最高（0.01%、0.03%、0.09%）。對(duì)于其他組，腹脹受試患者（A1_S6）的瘤胃乳酸桿菌（Lactobacillus ruminis）在益生菌劑干預(yù)第6周時(shí)相對(duì)豐度（0.12%）最高；腸易激綜合征患者（I1_S1、I1_S2、I1_S4）及排便不規(guī)律患者（N1_S6）的Bacteroides coprophilus在第1～6周時(shí)開始出現(xiàn)。

3 討 論

由于腸道微生物可以吸收宿主自身難以消化吸收的成分及分泌到腸腔中的物質(zhì)，所以腸道微生物的組成會(huì)隨機(jī)體攝入的食物成分的改變而變化。也就是說，膳食結(jié)構(gòu)是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能最為重要的因素，不當(dāng)?shù)娘嬍硶?huì)擾亂腸道微生物和宿主之間的穩(wěn)態(tài)平衡，造成腸道菌群失調(diào)進(jìn)而誘發(fā)多種腸道疾病，益生菌劑作為一種常見食品被用于調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)可有效地預(yù)防甚至是治療相關(guān)疾病[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)受試人群糞便樣本的測(cè)序和解析發(fā)現(xiàn)，益生菌劑對(duì)便秘、腹瀉和其他癥狀受試人群腸道菌群多樣性及物種相對(duì)豐度均有積極的調(diào)整作用，都使之向健康狀態(tài)靠近。在門水平上，各組受試人群腸道菌群以Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria為優(yōu)勢(shì)菌門，與前人研究中這4 種優(yōu)勢(shì)菌門達(dá)90%以上的結(jié)論[15]一致，造成腸道微生物門水平多樣性較低的原因有兩個(gè)，一方面源于宿主對(duì)胃腸道微生物組成及其功能的選擇性壓力，另一方面可能是與地球漫長(zhǎng)的歷史相比，人類進(jìn)化史相對(duì)較短而造成的[16]。但是，腸道微生物的相對(duì)豐度在益生菌劑干預(yù)期間乃至干預(yù)停止后起到了調(diào)整作用，符合Murphy等[17]得出的“改變飲食可以影響腸道微生物的結(jié)構(gòu)”的結(jié)論。其中，便秘組受試人群中Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria這3 種優(yōu)勢(shì)菌門在益生菌劑干預(yù)第4周時(shí)達(dá)到與對(duì)照組最接近的狀態(tài)，這說明益生菌劑能夠在較短的時(shí)間影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)。并且，在整個(gè)干預(yù)階段，Bacteroidetes的相對(duì)豐度隨著益生菌劑的干預(yù)由最初的84.27%降到44.78%；Firmicutes雖略有波動(dòng)，但是總體呈上升趨勢(shì)；Proteobacteria相對(duì)豐度隨益生菌劑干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降低后升高的起伏波動(dòng)狀態(tài)。這提示益生菌劑能夠降低便秘人群中起促炎作用的Bacteroidetes，升高Firmicutes的相對(duì)豐度。Cyanobacteria和Fusobacteria在益生菌劑的干預(yù)下達(dá)到了從零到0.001 7%的狀態(tài)；但是，益生菌劑停止干預(yù)后又恢復(fù)到了干預(yù)前的狀態(tài)，這也有力地支持了服用益生菌制品對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)以及對(duì)宿主健康狀況的作用存在短期功效的事實(shí)。同樣，益生菌劑對(duì)腹瀉組受試人群的Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria表現(xiàn)積極的調(diào)整作用，除Proteobacteria在干預(yù)4 周后與健康對(duì)照組（6.87%）最為接近外，其余兩種均在干預(yù)停止后保持在84.17%、8.06%，與健康對(duì)照組接近。就其他健康狀況的受試人群來說，Bacteroidetes和Firmicutes在干預(yù)第4周以及Proteobacteria和Actinobacteria在干預(yù)3周前與對(duì)照組最為接近，說明益生菌劑具有調(diào)整其他組健康狀況人群的Bacteroidetes和Firmicutes、提高Proteobacteria和Actinobacteria相對(duì)豐度的作用。但是，在停止干預(yù)后，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria并沒有保持不變而是呈現(xiàn)降低的狀態(tài)。以上都體現(xiàn)了益生菌劑一方面補(bǔ)充腸道的正常菌群或促進(jìn)有益菌的增殖，另一方面拮抗病原菌[18]。在短期內(nèi)腸道菌群相對(duì)豐度相應(yīng)改變也說明腸道微生物能夠?qū)σ嫔鷦┑慕槿胙杆僮龀龇磻?yīng)，這可能與各菌門的代謝產(chǎn)物（如短鏈脂肪酸）有關(guān)，腸道微生物在腸道內(nèi)將多糖降解成單糖和短鏈脂肪酸，提高能量利用效率，而短鏈脂肪酸是結(jié)腸和小腸上皮細(xì)胞的主要供能物質(zhì)，能夠較強(qiáng)地維護(hù)腸道形態(tài)及功能，并對(duì)腸道疾病具有一定的治療作用，也是研究益生菌劑對(duì)腸道微生物影響的重要指標(biāo)[19]。有報(bào)道指出，Bacteroidetes以生成乙酸和丙酸為主，而Firmicutes以生成丁酸為主[20]。Bacteroidetes首先將丙酮酸氧化成乙酰輔酶A，然后經(jīng)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶生成乙酸[21]；此外，Bacteroidetes生成丙酮酸還可通過丙烯酸途徑形成丙酸[22]。Firmicutes首先將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，然后通過丁酰輔酶A的生成等一系列途徑生成丁酸[23]。乙酸和丙酸可抑制腫瘤壞死因子-α的釋放，對(duì)結(jié)腸炎有良好的治療效果；丁酸能有效抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的凋亡、影響原癌基因的表達(dá)，從而預(yù)防和治療結(jié)腸癌[24-26]。但是，停止干預(yù)后部分腸道微生物向干預(yù)前狀態(tài)恢復(fù)的現(xiàn)象與Carmody等[27]提出的“腸道菌群存在一種記憶效應(yīng)”之說有關(guān)，即在飲食（如益生菌劑）干預(yù)后，它的組成和代謝狀況除了依賴于當(dāng)前的飲食，也少部分依賴于它之前的飲食，正如Zhang Chenhong等[28]的研究結(jié)果，這并不意味著無論如何破壞菌群結(jié)構(gòu)都能使之得到恢復(fù)。

其次，就科水平而言，3 組受試人群中這些優(yōu)勢(shì)菌科的相對(duì)豐度均有調(diào)整，但是，在干預(yù)第4周時(shí)部分菌科相對(duì)豐度調(diào)整較好。便秘組Alcaligenaceae、Rikenellaceae、Coriobacteriaceae由最初的2.58%、1.85%、0.005%分別調(diào)整至3.45%、0.72%、0.1%，接近于健康對(duì)照組（4.22%、0.58%、0.088%）；腹瀉組Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、Erysipelotrichaceae及Veillonellaceae由最初的1.87%、1.73%、0.07%、3.06%分別調(diào)整至4.39%、4.46%、0.23%、2.16%，接近于健康對(duì)照組（5.49%、4.22%、0.24%、2.20%）；并且，Lachnospiraceae在停止干預(yù)后仍保持在4.70%左右；其他組Enterobacteriaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae分別從干預(yù)前的0.19%、0.0033%、0.32%、0.23%、0.17%提升至1.50%、0.19%、0.59%、0.38%、0.20%，接近于健康對(duì)照組相對(duì)豐度（1.49%、0.12%、0.58%、0.44%、0.28%）。以上結(jié)果提示益生菌劑能夠通過提高便秘組受試人群的Alcaligenaceae和Coriobacteriaceae并降低Rikenellaceae，提高腹瀉組的Lachnospiraceae、Alcaligenaceae和Erysipelotrichaceae并降低Veillonellaceae，提高其他組Enterobacteriaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae來改善病理狀態(tài)人群腸道菌群相對(duì)豐度，這可能與菌科本身所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物功能相關(guān)，Enterobacteriaceae、Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Clostridiaceae以及Bifidobacteriaceae這幾個(gè)菌科與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生相關(guān)，尤其是Lachnospiraceae中的Blautia、Coprococcus、Lachnospira以及Roseburia都能參與到將碳水化合物分解為短鏈脂肪酸的代謝過程中，特別是Roseburia、Blautia以及Lachnospira主要參與丁酸鹽的產(chǎn)生，丁酸鹽不僅是上皮細(xì)胞的能量來源，可以通過組蛋白的高度乙?；鸵种坪艘蜃?κB信號(hào)通路來作為腸黏膜促炎細(xì)胞因子表達(dá)的抑制劑，還可以促進(jìn)黏蛋白和抗菌肽的產(chǎn)生來增強(qiáng)腸屏障功能，通過直接提高緊密結(jié)合蛋白的表達(dá)來增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的完整性，影響細(xì)胞的功能和結(jié)腸的健康，具有抗癌和抗炎的潛在功能，這些菌的減少往往會(huì)引起丁酸鹽的減少，Enterobacteriaceae可能與炎癥和胰島素抵抗有關(guān)，梭菌（Clostridium）可利用多種氨基酸，相應(yīng)生成多種有機(jī)酸，通過丙烯酸途徑由丙氨酸產(chǎn)生丁酸，也可在蘇氨酸脫水酶和酮酸脫氫酶的參與下由蘇氨酸產(chǎn)生丙酸[29-30]。此外，益生菌劑停止干預(yù)后各菌群相對(duì)豐度又逐漸向干預(yù)前恢復(fù)，這再次說明益生菌劑具有短期調(diào)整腸道菌群的效力。

然后，對(duì)屬水平進(jìn)行Welch’s t-test檢驗(yàn)及Stamp分析發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)存在顯著差異的菌屬，經(jīng)PCA鑒定，它們也是造成不同健康狀況組與健康對(duì)照組間存在顯著差異的關(guān)鍵菌屬，提示益生菌劑干預(yù)能夠引起20 個(gè)關(guān)鍵菌屬發(fā)生顯著變化。便秘組樣品隨著益生菌劑干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)距離健康對(duì)照組越來越遠(yuǎn)；腹瀉組在益生菌劑干預(yù)時(shí)直至停止干預(yù)后都逐漸向健康對(duì)照組接近；其他組樣品在益生菌劑干預(yù)期間也表現(xiàn)向健康對(duì)照組靠近的趨勢(shì)，但是在停止干預(yù)后并沒有繼續(xù)保持這種狀態(tài)，這提示益生菌劑對(duì)腹瀉組的調(diào)整效果優(yōu)于其他兩組。此外，研究結(jié)果顯示，在益生菌劑的干預(yù)下，便秘組Prevotella、Megamonas、Collinsella，腹瀉組Faecalibacterium、Acinetobacter、Blautia、Clostridium、Dialister、Eggerthella、Granulicatella、Lactobacillus、Oxalobacter、Pyramidobacter以及其他組Adlercreutzia、Collinsella、Klebsiella、Parabacteroides和Sutterella相對(duì)豐度提高，同時(shí)，便秘組Bacteroides和Odoribacter相對(duì)豐度降低，這20 個(gè)關(guān)鍵菌屬中大部分是對(duì)腸道健康有益的菌屬，但是也有病原菌，其中，Bacteroides、Faecalibacterium、Blautia是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生菌屬，F(xiàn)aecalibacterium與抗炎相關(guān)，Collinsella與促炎作用相關(guān)，Parabacteroides和Klesbsiella是能夠引起腹腔內(nèi)膜感染、腹瀉等病癥的相關(guān)致病菌，Blautia可將腸道中氣體轉(zhuǎn)化成乙酸，使氣體得以清除[31]。這提示益生菌劑能夠通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵菌屬豐度比例來調(diào)整腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，可能與菌屬本身及其代謝產(chǎn)物的抗炎、促炎作用具有密切的聯(lián)系，同時(shí)也說明菌群的多樣性與受試人群本身病理狀態(tài)有很大的相關(guān)性。

本研究對(duì)受試人群種水平的變化進(jìn)行了探究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)出的腸道菌群大多屬于擬桿菌型，這與Arumugam等[32]提出的腸型之說相符；Wang Tingting等[33]采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)腸道菌群16S rRNA V3分析也確定健康人群腸道中富集了普通擬桿菌和單形擬桿菌。便秘組Akkermansia muciniphila、Eubacterium biforme在第2周，Bacteroides fragilis、Faecalibacterium prausnitzii在第5周至停止，Ruminococcus gnavus在第4周及停止干預(yù)后的第2周均在益生菌劑的干預(yù)下出現(xiàn)，且含量分別高達(dá)0.42%、0.02%、16.17%、2.99%、0.08%，Bacteroides ovatus和Prevotella stercorea則隨干預(yù)時(shí)長(zhǎng)降低。其中，Akkermansia muciniphila被認(rèn)為是健康人體腸道中最豐富的黏液溶解細(xì)菌，其數(shù)目和乙酸鹽、丁酸鹽含量之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，在降解黏蛋白的同時(shí)會(huì)釋放乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，腸道中低水平的Akkermansia muciniphila可能導(dǎo)致黏膜層的變薄，從而導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，使腸道內(nèi)的毒素更容易侵入人體[34-35]。Bacteroides fragilis是人體結(jié)腸中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌，它通過產(chǎn)生獨(dú)特的莢膜多糖A改變其表面抗原性，當(dāng)其含量過低時(shí)會(huì)引起腸道炎癥[36]。Faecalibacterium prausnitzii是腸道共生菌，是硬壁菌門的主要成員，能通過產(chǎn)丁酸鹽為腸道提供能量并發(fā)揮抗炎作用[37]。Bacteroides ovatus能夠降解人體不能代謝的植物多糖，為宿主提供來自食物的10%～15%的能量[38]。腹瀉組的Bifidobacterium longum、Bacteroides stercoris在第6周（9.09%、0.33%）、Actinobacillus parahaemolyticus在第1周（0.12%）、Anoxybacillus kestanbolensis在第4周（0.07%）、Lactobacillus brevis、Blautia producta及Eubacterium dolichum在停止干預(yù)后（0.01%、0.03%、0.09%）均出現(xiàn)。對(duì)于其他組而言，在益生菌劑干預(yù)下，腹脹受試患者（A1_S6）的瘤胃乳酸桿菌（Lactobacillus ruminis）在益生菌劑干預(yù)第6周（0.12%）、腸易激綜合征患者（I1_S1、I1_S2、I1_S4）及排便不規(guī)律患者（N1_S6）的Bacteroides coprophilus在第1～6周時(shí)開始出現(xiàn)，這提示益生菌劑具有短期調(diào)控菌群多樣性及相對(duì)豐度的作用，并且通過菌群的代謝產(chǎn)物的有益作用達(dá)到益生功能。由于這些菌種含量過低不易檢測(cè)，再加上益生菌劑對(duì)于單個(gè)菌種的持續(xù)作用并不明顯，再次印證了益生菌劑干預(yù)下種水平的不顯著變化可能與受試人群的病理狀態(tài)有關(guān)。此外，對(duì)一些機(jī)制不明的菌有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)不同健康狀況受試人群施于益生菌劑的干預(yù)，采集糞便，利用Ion Torrent PGM測(cè)序技術(shù)和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析得知，益生菌劑對(duì)受試人群腸道微生物多樣性均有不同程度的調(diào)整作用。益生菌劑能夠降低便秘人群Bacteroidetes、Rikenellaceae，升高Firmicutes、Alcaligenaceae、Coriobacteriaceae的相對(duì)豐度，提高腹瀉人群Proteobacteria、Alcaligenaceae、Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae并降低Veillonellaceae，提高健康狀況人群Proteobacteria、Actinobacteria、Enterobacteriaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae，使其相對(duì)豐度向健康人群靠近。并且，益生菌劑在屬水平上對(duì)腹瀉組的調(diào)整效果優(yōu)于其他兩組。重要的是，Akkermansia muciniphila、Bacteroides fragilis及Faecalibacterium prausnitzii等的相對(duì)豐度有不同程度的提高，這些菌的出現(xiàn)將對(duì)維護(hù)宿主健康具有價(jià)值。因此本研究認(rèn)為，益生菌劑能起到改變腸道微生物多樣性的功效，可以通過調(diào)整關(guān)鍵菌群間的豐度比例起到抑制腸道有害微生物生長(zhǎng)、促進(jìn)部分有益菌的增殖并維持腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)的作用，進(jìn)一步明確了利用益生菌劑調(diào)節(jié)和恢復(fù)便秘、腹瀉人群腸道健康具有科學(xué)價(jià)值。