王 峰 李 忠 苗貴東 1，2,

（1.貴州省化學(xué)合成及環(huán)境污染控制和修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 興義 562400 2.民族藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 興義 562400 3.興義民族師范學(xué)院， 貴州 興義 562400）

水產(chǎn)生物特別是大型經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)生物是人類優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源，開展水產(chǎn)生物基因功能研究，揭示其遺傳發(fā)育規(guī)律，發(fā)掘和利用遺傳資源培育高產(chǎn)、抗病抗逆品種，不僅具有重要的科學(xué)意義也具有巨大的經(jīng)濟(jì)利益。近十年來,隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,斑馬魚（Barchydaniorerio var）、鯉魚（Cyprinuscarpio）、斑點(diǎn)叉尾鮰（IetalurusPunetaus）、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、牙鲆、草魚、翹嘴紅鲌（Erythroculterilishaeformis）、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala）、尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）、青鳉（Oryzias latipes）、棕刺尻魚（CentropygevroOreochromis niloticuslikii）、佛羅里達(dá)文昌魚（Branchiostoma floridae）、大黃魚（Larimichthyscrocea）、大西洋鮭、大西洋鱈、石斑魚、白鰭豚、小須鯨、揚(yáng)子鱷、南美白對(duì)蝦、中華絨螯蟹、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝[、牡蠣(Crassostreagigas)、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)、海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)、海帶(Saccharinajaponica)、海膽等[1-10]近百種水產(chǎn)生物的基因組已被測(cè)序，同時(shí)今后每年都會(huì)有多種水產(chǎn)生物基因組數(shù)據(jù)完成測(cè)序工作,這將為水產(chǎn)生物學(xué)的研究者們提供了比以往更加豐富的遺傳信息資源。

隨著水產(chǎn)生物基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及全轉(zhuǎn)錄組研究的進(jìn)步，水產(chǎn)生物研究也進(jìn)入后基因組時(shí)代，開展功能基因組分析成為水產(chǎn)科技工作者迫切需要解決的重大科學(xué)問題，在反向遺傳學(xué)研究的過程中誕生了基因重組，RNAi干擾、基因敲降[24]和人工核酸酶技術(shù)（鋅指核酸復(fù)合酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）、成簇規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù) (CRISPR)技術(shù)）?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)為快速、高效驗(yàn)證基因功能提供的最有效的技術(shù)手段。基因編輯是一種對(duì)基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定點(diǎn)修飾、定向敲除或敲入外源的DNA序列，使之產(chǎn)生可遺傳的改變的技術(shù)。與射線誘導(dǎo)和化學(xué)誘變相比，具有高效、可控和定向操作的特點(diǎn)。基因編輯技術(shù)被麻省理工科技評(píng)論評(píng)為2014年十大突破性科學(xué)技術(shù),其中CRISPR還獲得了2015年度生命科學(xué)突破大獎(jiǎng)[10]。目前主流的基因編輯技術(shù)有RNA干擾（RNAi）、鋅指核酸復(fù)合酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）、成簇規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù) (CRISPR)技術(shù)。本文將從技術(shù)發(fā)展、原理及在水產(chǎn)生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述，并對(duì)其在水產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

一、水產(chǎn)生物主要基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)(Gene Editing)能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、敲入等操作。目前水產(chǎn)生物基因編輯技術(shù)主要有轉(zhuǎn)錄水平中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控技術(shù)RNA干擾（RNAi）和核酸水平人工核酸酶技術(shù)。其中主要的人工核酸酶技術(shù)有鋅指核酸酶(Zincfinger nucleases,ZFNs)技術(shù)，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)和成簇規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)(CRISPR)技術(shù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技術(shù)。

二、水產(chǎn)生物基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

（一）RNA干擾（RNAi）技術(shù)

RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源 mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。1995年Guo和Kemphues[12]在研究中發(fā)現(xiàn)秀麗新小桿線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)注射正義RNA（senseRNA）和反義RNA均能有效并特異性地抑制par-1基因的表達(dá)，該結(jié)果不能使用反義RNA技術(shù)的理論做出合理解釋。該現(xiàn)象于1998年被Fire等[13]研究證實(shí)正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。1999 年和 2001 年 David Baulcombe[14]和Thomas Tuschl[15]分別在植物與動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)小干擾RNA（Smallinterfering RNA,SiRNA）現(xiàn)象。

RNAi干擾作用機(jī)制分兩個(gè)階段，起始階段和效應(yīng)階段。起始階段：外源或內(nèi)源的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后, 被Dicer酶劈成21-23個(gè)堿基的小片段(Small interfering RNA, siRNA),效應(yīng)階段：siRNA和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物 (RNA Induced Silencing Complex,RISC)相結(jié)合, 結(jié)合后的復(fù)合物具有核酸酶的作用，能識(shí)別并降解目標(biāo)RNA。

1.RNAi在水產(chǎn)生物中的應(yīng)用

RNAi在魚類中的應(yīng)用目前主要是在方法構(gòu)建、抗病毒機(jī)制、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育與基因功能研究中。Wargelius等[16]首先通過顯微注射研究了dsRNA在斑馬魚（Brachydaniorerio）胚胎中介導(dǎo)的RNAi效果，發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后斑馬魚出現(xiàn)了預(yù)期的表型缺陷和mRNA水平的降低的現(xiàn)象，25%的胚胎表現(xiàn)出特異表型缺陷,同時(shí)也出現(xiàn)了數(shù)量相當(dāng)?shù)姆翘禺愋员硇腿笔Аndrews進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RNAi會(huì)引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄水平降低，證明RNAi通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[17]。小RNAi現(xiàn)象在斑馬魚[18]和硬頭鱒中先后被發(fā)現(xiàn)。

在魚類RNAi在抗病毒機(jī)制與應(yīng)用研究方面發(fā)現(xiàn)，Xie等[19]研究了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染外源siRNA和商業(yè)干擾載體在魚體內(nèi)干擾病毒復(fù)制，發(fā)現(xiàn)外源轉(zhuǎn)染siRNA能更有效的干擾目的基因，且能夠有效延緩虎紋蛙虹彩病毒 (Iridovirus tiger frog virus) 在魚細(xì)胞中的增殖過程。Dang等[20]也發(fā)現(xiàn)RNAi在魚類細(xì)胞中能夠有效延緩真鯛虹彩病毒(red seabream irido virus)的增殖。

在魚類基因功能分析方面，Acosta等[21]通過顯微注射dsRNA的方法研究了Myostatin基因在魚類生長(zhǎng)中的作用,發(fā)現(xiàn)沉默該基因能夠促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)，表明該基因在魚類中的作用與其他動(dòng)物類似，均是肌肉生長(zhǎng)的負(fù)向調(diào)控基因。Chang[22]和Huang等通過RNAi實(shí)現(xiàn)對(duì)斑馬魚zfPGRP6，GtHα，F(xiàn)SHβ，andLHβ等基因的沉默分析，并對(duì)這些基因進(jìn)行了初步功能驗(yàn)證與分析。

黎雙飛等[23]在魚類活體實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域通過顯微注射的方法，將表達(dá)GnRH反義鏈的載體注射入鯉魚（Cyprinuscarpio）受精卵獲得了育性可控的轉(zhuǎn)基因魚，其極低的繁殖能力能夠遺傳給后代。Lin等[24]通過構(gòu)建人工內(nèi)含子形式的MicroRNA,經(jīng)過病毒包裝后侵染幼魚或受精卵能有效的在斑馬魚體內(nèi)形成組織特異性的基因沉默，且有望形成穩(wěn)定遺傳品系。由此將RNAi載體通過轉(zhuǎn)基因的途徑來開發(fā)出具有特定性狀的魚或其他水生生物具有極大的科研和應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)用基因沉默的方法阻止斑馬魚GnRH2或GnRH3的mRNA翻譯時(shí)，發(fā)現(xiàn)在中-后腦和間中腦邊界處，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)或pax2.1基因的表達(dá)產(chǎn)生了變化。同時(shí)在斑馬魚發(fā)育過程研究中也發(fā)現(xiàn)GnRH基因的功能喪失會(huì)影響到早期腦和眼的形成。

RNAi在甲殼動(dòng)物中研究主要體現(xiàn)在方法構(gòu)建，抗病毒機(jī)制和基因表達(dá)調(diào)控與基因功能等方面，Su[25]和Xu[26]等分別在黑虎蝦及日本對(duì)蝦中構(gòu)建了RNAi技術(shù)方法，表現(xiàn)出了基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因沉默現(xiàn)象。

在甲殼類動(dòng)物抗病毒及免疫方面，Kim等[27]首次在感染W(wǎng)SSV和TSV的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）中分別注射綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、鯰（Ictaluruspunctatus）和 野 豬(Susscr of a)的免疫球蛋白基因dsRNA。結(jié)果顯示，注射異源物種dsRNA的實(shí)驗(yàn)組死亡率下降到對(duì)照組的50%-70%。Kim等進(jìn)一步將VP28和VP281的長(zhǎng)鏈dsRNA注射到感染W(wǎng)SSV的中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeuschinensis）體內(nèi)，也表現(xiàn)出比對(duì)照組更高的存活率。Xu等[26]將短鏈VP28的dsRNA注射到日本囊對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)體內(nèi)，也發(fā)現(xiàn)有類似的結(jié)果。研究表明斑節(jié)對(duì)蝦的Rab7可以與VP28結(jié)合，在WSSV侵染對(duì)蝦的過程中發(fā)揮重要作用。Ongvarrasopone等[28]在斑節(jié)對(duì)蝦中通過注射Rab7的dsRNA降低Rab7基因的表達(dá)量，從而有效抑制YHV和WSSV感染對(duì)蝦，推測(cè)Rab7蛋白可能是參與了病毒復(fù)制過程中的內(nèi)吞作用。在TSV侵染蝦體的研究中也獲得了相似的結(jié)果，Ongvarrasopone等[29]在TSV侵染凡納濱對(duì)蝦48h之后注射Rab7的dsRNA,有效地抑制TSV的復(fù)制，提高了蝦的成活率。Xu等[26]同樣采取基因干擾技術(shù)研究蝦類白斑綜合癥病毒(white spotsyndrome virus)時(shí)發(fā)現(xiàn)siRNA能有效的提高蝦類對(duì)病毒的免疫力，連續(xù)注射甚至能讓染病的蝦體內(nèi)的病毒消失。這表明脊椎動(dòng)物免疫球蛋白基因dsRNA作為外源性物質(zhì)注射到凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)，激活了蝦先天性的免疫反應(yīng)。研究認(rèn)為RNAi能夠在蝦類體內(nèi)誘發(fā)序列特異性的基因沉默，并有可能發(fā)展成為一種新的抗病毒治療途徑。但在其他甲殼類動(dòng)物中是否也存在完整的RNAi系統(tǒng)還需要開展進(jìn)一步的研究。

在基因表達(dá)與基因功能研究領(lǐng)域，在對(duì)蝦研究中，通過RNAi技術(shù)，在45d的長(zhǎng)期干擾MSTN/GDF-11基因的表達(dá)，結(jié)果顯示干擾組斑節(jié)對(duì)蝦的增重僅為對(duì)照組的32%。在凡納濱對(duì)蝦研究中[30]，經(jīng)過8周的干擾，增重率顯著低于對(duì)照組并且實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)較高的死亡率(71%)。上述結(jié)果揭示MSTN/GDF-11基因與甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有密切關(guān)系。

（二）人工核酸酶技術(shù)

通過轉(zhuǎn)座子和同源重組技術(shù)在斑馬魚、青鱂等模式生物上實(shí)現(xiàn)了基因敲除，但是基因敲除效率很低；利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法也能獲得斑馬魚隨機(jī)的基因突變，但該方法存在周期長(zhǎng)、篩選困難、成本高、不能準(zhǔn)確改變特定基因等缺點(diǎn)。使用RNAi技術(shù)雖然可以在短時(shí)間導(dǎo)致靶基因表達(dá)量降低，用以研究靶基因的功能，但該技術(shù)無法獲得穩(wěn)定遺傳突變體。因此這些研究基因功能技術(shù)受到各自技術(shù)瓶頸制約，使得水產(chǎn)生物基因的研究大都停留在基因克隆和表達(dá)分析等方面，基因功能方面研究進(jìn)展緩慢，人工核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)為高效、低成本、高穩(wěn)定性突變體構(gòu)建及實(shí)現(xiàn)基因功能研究帶來巨大的技術(shù)突破，極大促進(jìn)了水產(chǎn)生物基因功能研究。

1.三種人工核酶技術(shù)的原理

人工核酸酶技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的一類全新的基因編輯技術(shù)。人工核酸酶是一類人工構(gòu)建的能識(shí)別特定DNA序列并能在DNA分子上形成雙鏈切割(Double strand breaks, DSB)的核酸酶。其工作機(jī)制是受損的DNA通過兩種修復(fù)機(jī)制,即同源重組(Homologous recombination,HR)和非同源末端連接(Non-homologous end jointing, NHEJ)[31,32]進(jìn)行修復(fù)。在動(dòng)物細(xì)胞中非同源末端連接是一種重要的易錯(cuò)修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)過程中，DNA雙鏈?zhǔn)軗p部位會(huì)插入或缺失部分堿基，當(dāng)插入或缺失堿基數(shù)不為3或3的倍數(shù)并且處于基因開放閱讀框內(nèi)時(shí)，就會(huì)造成基因的移碼突變，使這個(gè)開放閱讀框的信息不能正確翻譯，從而發(fā)生基因敲除的現(xiàn)象[33]。而在真核生物釀酒酵母細(xì)胞中，同源重組則是一種占統(tǒng)治地位的修復(fù)機(jī)制，二倍體釀酒酵母通過另一條染色體作為模板提供正確片段的供體來修復(fù)受損的DNA，當(dāng)人工核酸酶的切割發(fā)生在單倍體釀酒酵母中時(shí)，通過提供人工設(shè)計(jì)的供體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單倍體釀酒酵母的定點(diǎn)基因編輯[34]。

圖1.結(jié)合到DNA（橙色）上的鋅指核酸酶（藍(lán)色）引自維基共享資源，thomas Splettstoesser

人工核酸酶技術(shù)目前形成3種代表性的技術(shù)，即鋅指核酸酶技術(shù) (Zinc finger nucleases,ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和CRISPR/Cas9技術(shù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9)。

2.鋅指核酸酶(Zincfinger nucleases,ZFNs)技術(shù)

鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFNs)，又名鋅指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶（圖1），由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，其中DNA識(shí)別域賦予特異性，在DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，而非特異性核酸內(nèi)切酶賦剪切功能，兩者結(jié)合就可在DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)斷裂。

鋅指蛋白源自轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族（圖2）DNA識(shí)別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，研究還表明每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合3′到5′方向DNA鏈上一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基以及5′到3′方向的一個(gè)堿基。

圖2 Cys2-His2鋅指單元首先是在TFIIIA中鑒定出的。TFIIIA含有9個(gè)大約30個(gè)氨基酸基序的串聯(lián)重復(fù)。

鋅指核酸酶是第一代人工核酸酶技術(shù)。1985年 Mille等[35]在研究非洲爪蟾（Xenopuslaevis）的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白。鋅指核酸酶在水產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用主要是方法建立，基因功能分析。Meng[36]和Doyon[37]等先后利用鋅指核酸酶技術(shù)定向敲除了斑馬魚中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體基因kdr和胚胎色素基因golden和notail基因，使斑馬魚作為模式動(dòng)物開展基因的功能研究成為可能。王雯雯等[38]在利用鋅指蛋白酶構(gòu)建了斑馬魚基因敲除的實(shí)驗(yàn)體系，鋅指核酸酶技術(shù)研究開始在國(guó)內(nèi)起步。但是由于鋅指核酸酶由技術(shù)由于于操作難度、復(fù)雜性及價(jià)格原因未能得到大規(guī)模應(yīng)用，隨著第二代核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)，其逐步被第二代核酸酶技術(shù)所取代。

3.類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）技術(shù)

TALEN技術(shù)是屬于第二代人工核酶技術(shù)，是二聚的轉(zhuǎn)錄因子/核酸酶，由33至35個(gè)氨基酸模塊構(gòu)成，包含核定位信號(hào)的N端結(jié)構(gòu)域、識(shí)別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域和具有FokI 核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域。其中每模塊靶定特定核苷酸序列。通過組裝這些模塊，研究人員可靶定他們想要的任何序列。其特點(diǎn)是在同一蛋白（TALEN）上，實(shí)現(xiàn)有序?qū)崿F(xiàn)引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞核、靶位點(diǎn)DNA的特異性識(shí)別和靶位點(diǎn)DNA的切割三個(gè)不同功能。

Hosoi等[39]在海膽]建立了TALEN基因組編輯技術(shù)，2012年Stephen Ekker[40]在Nature發(fā)表首次在斑馬魚上，構(gòu)建基于TALEN技術(shù)的魚類基因編輯方法。Qiu等[41]利用TALEN技術(shù)構(gòu)建了高效敲出青鳉中轉(zhuǎn)入的GFP報(bào)告基因的方法，表明TALEN技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域初步實(shí)現(xiàn)。

TALEN技術(shù)應(yīng)用主要在魚類功能分析領(lǐng)域，熊小杰等[42]和郭瀟[43]等利用TALEN技術(shù)分別敲除斑馬魚 IDH 和aftpha、sertad2a、si:ch73-131e21.5、panel、si:ch211-89o9.6、rsph3及rsph4a基因。Treen等[44]通過電穿孔的方式把TALEN成功轉(zhuǎn)入到海鞘里，實(shí)現(xiàn)了整體或者特定組織敲除，并且開發(fā)了相應(yīng)的突變檢測(cè)方法提高了檢測(cè)效率，研究中發(fā)現(xiàn)在特定地敲除上皮組織里的Hox12基因和神經(jīng)組織里的Fgf3基因過程中發(fā)現(xiàn)，在敲除Fgf3基因時(shí)發(fā)現(xiàn)了此基因在海鞘類幼體變態(tài)階段的新的功能。崔忠凱[45]等利用TALEN技術(shù)成功敲除了半滑舌鰨Z染色體上的dmrt1基因，并獲得了33尾基因突變魚，確切證明dmrt1是魚類雄性性別決定的關(guān)鍵基因。Lau等[46]利用TALEN技術(shù)敲除斑馬魚卵巢芳香化酶基因cyp19a1a基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其子代由于性腺分化失敗，全部表現(xiàn)為雄性，研究結(jié)果證明了卵巢芳香化酶基因在卵巢分化和發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)卵巢芳香化酶不會(huì)影響早期卵巢及初級(jí)卵細(xì)胞生成，但是該基因?qū)τ谠缙诼殉舶l(fā)育為成熟卵巢起到關(guān)鍵作用。

4.成簇規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)(CRISPR)技術(shù) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技術(shù)

2002年荷蘭烏得勒支(Utrecht)大學(xué)Jansen[47]在Molecular Microbiology雜志上發(fā)表了他們利用生物信息工具對(duì)一系列古菌和細(xì)菌的重復(fù)序列進(jìn)行了分析的文章。2007年法國(guó)Danisco公司的Philippe Horvath與其同事Barrangou[48]等Science雜志上正式發(fā)表了研究論文，在文章中首次將這個(gè)重復(fù)序列命名為Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,簡(jiǎn)稱CRISPR，同時(shí)也首次使用CRISPR-associated(Cas)這個(gè)概念。

2013年Mali[49]和Cong[50]實(shí)驗(yàn)室分別發(fā)表了基于CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該方法利用改造自細(xì)菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，是繼鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN等技術(shù)后可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動(dòng)物的第三種人工核酶技術(shù)，被稱為第三代人工核酸酶。相比ZFN和TALEN技術(shù),CRISPR技術(shù)具有更加經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，在應(yīng)用中只用到Cas9蛋白和sgRNA兩個(gè)元件，針對(duì)不同的靶點(diǎn)序列只需改變sgRNA上約20nt的識(shí)別序列即可。同時(shí)，該技術(shù)體現(xiàn)出的效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，在動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景廣闊的特點(diǎn)，使其出現(xiàn)后就迅速在多種生物中得到成功應(yīng)用，并逐步取代了ZFNs和TALEN兩種技術(shù)[51]。

Niu等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功對(duì)靈長(zhǎng)類的動(dòng)物食蟹猴進(jìn)行了精確的基因編輯，在該項(xiàng)研究中，以食蟹猴胚胎中的Nr0b1、Ppar-r和Rag1等基因作為靶位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ppar-r和Rag1出現(xiàn)突變，隨后經(jīng)代孕后生出的子代孿生猴也被證實(shí)存在Ppar-r和Rag1基因突變，因此研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅具有高效的特點(diǎn)，還能夠穩(wěn)定遺傳給后代，這為實(shí)現(xiàn)生物高效的基因改造奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

在水產(chǎn)生物中2013年Hwang等[53]在斑馬魚上實(shí)現(xiàn)用CRISPR-Cas系統(tǒng)高效的基因編輯。中國(guó)學(xué)者黃軍[54]首次利用CRISPR/Cas9開展人類胚胎基因編輯研究，引發(fā)學(xué)界對(duì)編輯技術(shù)的倫理思考。標(biāo)志基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從模式生物到智能生物的全覆蓋，也標(biāo)志著基因功能研究全面進(jìn)入基因編輯的新時(shí)代。

CRISPR/Cas9技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)生物研究中也逐步獲得發(fā)展。由于水產(chǎn)生物CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)起步晚及胚胎操作難度大、效率較低等問題，在水產(chǎn)生物中的應(yīng)用主要是在編輯方法建立研究方面，以斑馬魚為研究對(duì)象開展了方法優(yōu)化[55]、細(xì)胞系驗(yàn)證[56]、多種基因和多種方法[57,58]的嘗試均獲得基因編輯的良好效果。同時(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)在玻璃海鞘、海膽、?？?、大西洋角螺、、端足類動(dòng)物、脊尾白蝦、三角褐指藻、海七鰓鰻、大西洋鮭、青鳉[59-65]等十余種水產(chǎn)生物中均取得了成功，涵蓋了尾索動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、貝類、魚類、甲殼動(dòng)物和藻類等8個(gè)生物類群。在其他物種研究中Sasaki[66]和Stolfi等[67]分別對(duì)Hox家族基因中的Hox3、Hox5、Hox12及發(fā)育過程中決定細(xì)胞命運(yùn)的ebf基因進(jìn)行敲除及功能驗(yàn)證分析，構(gòu)建了玻璃海鞘引導(dǎo)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)，用于系統(tǒng)的玻璃海鞘功能基因的敲除。Chakrapani等[68]建立的鯉魚TLR22基因的基因編輯體系，Gui等[69]在脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）研究中成功的利用CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶基因EcChi4的敲除，并觀察了EcChi4敲除對(duì)脊尾白蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

三、基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)生物領(lǐng)域應(yīng)用的展望

由于水產(chǎn)生物技術(shù)起步較晚，目前缺乏成熟有效的基因編輯技術(shù)已成為制約開展基因功能研究的重要因素，基因組編輯技術(shù)的操作對(duì)象是基因組DNA,且主要是通過顯微注射對(duì)細(xì)胞系或胚胎進(jìn)行操作。而目前為止，水產(chǎn)生物細(xì)胞系較少，特別是甲殼類動(dòng)物還未形成成熟的細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)體系,且卵殼較硬易碎。顯微注射技術(shù)及去核操作難度大，成功率低，成為制約水產(chǎn)生物基因編輯技術(shù)應(yīng)用的主要瓶頸[10]。

RNAi、ZFN和TALEN技術(shù)在水產(chǎn)生物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病毒與免疫、基因功能及遺傳研究領(lǐng)域發(fā)揮了積極作用，但是隨著CRISPR技術(shù)出現(xiàn)，其系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)勢(shì)明顯，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物模型的快速制備、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及遺傳性疾病的治療[70]等。水產(chǎn)生物基因編輯技術(shù)主要研究各類編輯方法在不同類型水產(chǎn)生物方法建立，基因結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)，功能基因初步分析，完善的基因編輯方法與其他模式生物相比仍存在較大差異，還需在基因編輯技術(shù)專有設(shè)備，技術(shù)手段，編輯基因類型等方面根據(jù)水產(chǎn)生物胚胎特點(diǎn)不斷發(fā)展和完善，同時(shí)利用人工智能技術(shù)手段逐步提高人工智能領(lǐng)域在顯微注射及儀器實(shí)驗(yàn)精度的提高，減少對(duì)胚胎的影響，提高轉(zhuǎn)基因成功率及胚胎孵化效率。

美國(guó)FDA于2015年批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因三文魚上市銷售，成為首例獲準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[71]。同年Qian等[72]在利用鋅指核酸酶技術(shù)敲除了家豬(Susscr of adomestica)體內(nèi)抑制肌肉生長(zhǎng)的Mstn基因，獲得了肌肉含量更加豐富的家豬品種。利用CRISPR技術(shù)的基因編輯方法育種，基因工程手段用于遺傳育種有望逐漸被消費(fèi)者所認(rèn)可。通過基因編輯技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)更好的利用基因組信息和已發(fā)掘的遺傳資源，更加快速有效的獲得高產(chǎn)、單性及抗病抗逆[73]新品種，如果在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用推廣此項(xiàng)技術(shù)，敲除魚、蝦、貝類的肌肉抑制基因,增加抗病抗逆基因獲取更高肌肉含量且具有更強(qiáng)適應(yīng)性的的水產(chǎn)新品種將具有巨大的市場(chǎng)前景和良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，從而更好的為人們提供營(yíng)養(yǎng)豐富水產(chǎn)品。基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)中的應(yīng)用已成為一種趨勢(shì)，一定會(huì)在未來的水產(chǎn)生物技術(shù)研究中發(fā)揮越來越大的作用。