臧　威,劉春月,,謝廣發(fā),沈　赤,劉新展,鄒彗君,湯訪評(píng),馮富娟,孫劍秋,*,白逢彥

1 紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,紹興　312000 2 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱　150040 3 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,紹興　312000 4 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京　100101

酵母菌只是形態(tài)學(xué)術(shù)語(yǔ)而不是分類(lèi)學(xué)名詞,是一類(lèi)主要以芽殖或裂殖進(jìn)行無(wú)性繁殖、有性繁殖階段不形成子實(shí)體的單細(xì)胞真菌[1]。在植物、土壤、淡水、海水等生境中廣泛分布著各類(lèi)酵母菌,與人類(lèi)生活關(guān)系密切[2]。基于酵母菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品等行業(yè)和基礎(chǔ)研究、生態(tài)功能等領(lǐng)域的重要作用[1],考察和分離各種生境中存在的酵母菌資源是生物技術(shù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)[3],所以特定生境內(nèi)酵母菌類(lèi)群的分布情況一直受到廣泛關(guān)注。對(duì)于酒類(lèi)釀造[4- 7]、傳統(tǒng)食品發(fā)酵[8- 10]、水環(huán)境[11]、土壤[12]、植物表面[3,13- 15]、人體[16]和患處[17- 18]、極端環(huán)境[19]及其他生境[20]中酵母菌資源的研究成果也充分說(shuō)明,自然界中還有大量的酵母菌種類(lèi)亟待發(fā)現(xiàn)。

雁蕩山山脈位于浙江省東南部,綿延數(shù)百公里,按照地理位置可以分為北雁蕩山、中雁蕩山、南雁蕩山、西雁蕩山(澤雅)、東雁蕩山(洞頭半屏山),氣候溫和濕潤(rùn),適合酵母菌棲息繁殖,但是迄今對(duì)該地區(qū)野生酵母菌資源研究未見(jiàn)報(bào)道。我們采用經(jīng)典的酵母菌分離培養(yǎng)方法和現(xiàn)代酵母菌分子鑒定技術(shù),對(duì)雁蕩山山脈廣闊區(qū)域內(nèi)的葉棲酵母菌資源進(jìn)行考察,旨在弄清該地區(qū)葉棲酵母菌群落的多樣性、組成和結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)特殊酵母菌類(lèi)群以進(jìn)一步豐富我國(guó)酵母菌資源庫(kù)。

1　材料與方法

1.1　采樣地點(diǎn)

研究范圍集中在浙江省東南部雁蕩山地區(qū),包括北雁蕩山、中雁蕩山、南雁蕩山、西雁蕩山(澤雅)、東雁蕩山(洞頭半屏山),該地區(qū)屬亞熱帶海洋性氣候,雨量充沛、氣候溫暖,年平均氣溫13.5℃,年平均降雨量1935.6 mm,年平均無(wú)霜期269 d。

1.2　采樣方法

在2015—2016年間,自雁蕩山山脈采集樹(shù)木半枯葉片暫存于無(wú)菌自封袋內(nèi),盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行葉棲酵母菌的分離和純化。采樣過(guò)程中,對(duì)宿主植物信息、周?chē)h(huán)境、緯度和經(jīng)度等進(jìn)行詳細(xì)記載。

1.3　酵母菌分離

參照Nakase和Takashima方法[21]進(jìn)行。將采集的半枯葉片,用凡士林粘貼在PDA平板的皿蓋內(nèi)側(cè),在20℃下正置恒溫培養(yǎng)7 d,期間每天更換新鮮培養(yǎng)基。更換下的PDA平板在20℃下倒置培養(yǎng)至漸見(jiàn)菌落形成,挑取形態(tài)不同的酵母菌菌落進(jìn)行平板劃線,即可獲得葉棲酵母菌的純培養(yǎng)。

1.4　酵母菌DNA提取

挑取少量在PDA斜面上生長(zhǎng)旺盛的幼齡酵母菌菌體進(jìn)行DNA微量提取,參照Makimura方法[22]完成。

1.5　酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增

參考Kurtzman和Robnett方法[23],采用引物NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3′)和NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3′)對(duì)菌株26S rDNA D1/D2進(jìn)行擴(kuò)增,按照反應(yīng)條件94℃ 1 min,52℃ 1 min,72℃ 1 min擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。本研究中引物NL4和NL1的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,北京六合華大基因科技有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.6　序列分析

將測(cè)得酵母菌26S rDNA D1/D2序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search),比較實(shí)驗(yàn)菌株與已知菌株序列的相似程度。采用Clustal X軟件比對(duì)相應(yīng)模式菌株序列與實(shí)驗(yàn)菌株26S rDNA D1/D2序列的堿基差異[24]。通過(guò)MEGA5軟件和Neighbor-Joining方法,構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)以明確相關(guān)酵母菌的分類(lèi)地位[25- 26]。根據(jù)系統(tǒng)樹(shù)上標(biāo)注的序列號(hào)(accession numbers),可以從GeneBank下載相關(guān)菌株26S rDNA D1/D2參考序列。

1.7　數(shù)據(jù)分析

相對(duì)頻率(Relative frequency, RF)是指某雁蕩山地區(qū)分離到的某種葉棲酵母菌占該地區(qū)葉棲酵母菌總菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù),若≥1%則屬于常見(jiàn)種類(lèi)。

根據(jù)以下Shannon-Weiner公式計(jì)算多樣性指數(shù)(Diversity index,H′),式中k是指雁蕩山某地區(qū)分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)的總數(shù),Pi是指某種葉棲酵母菌的菌株數(shù)量占該地區(qū)葉棲酵母菌全部菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

豐度(Richness, R),是指某雁蕩山地區(qū)分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)數(shù)。

相似性系數(shù)(Similarity coefficients,Cs),根據(jù)Sorenson系數(shù)公式進(jìn)行計(jì)算,Cs=2j/(a+b),式中j是指雁蕩山山脈兩個(gè)地區(qū)之間都可以分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)數(shù),a是指雁蕩山山脈一個(gè)地區(qū)可以分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)數(shù),b是指雁蕩山山脈另一個(gè)地區(qū)可以分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)數(shù)。

采用bootstrap指數(shù)獲得期望物種豐富度(S),在如下計(jì)算公式中So代表雁蕩山某地區(qū)分離到的常見(jiàn)葉棲酵母菌種類(lèi)數(shù),Pk代表某種葉棲酵母菌的菌株數(shù)占該地區(qū)葉棲酵母菌全部菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù),m是指全部樣本數(shù)量。借助EstimateS軟件完成分析和計(jì)算,通過(guò)Excel繪制雁蕩山山脈葉棲酵母菌的物種累積曲線(Species accumulation curves)。

2　結(jié)果與分析

2.1　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的已知類(lèi)群

從北雁蕩山、中雁蕩山、南雁蕩山、西雁蕩山和東雁蕩山分別采集到樹(shù)木半枯葉片標(biāo)本30、32、30、31和30份,分離獲得酵母菌144、209、257、337株和171株。參照1118株酵母菌26S rDNA D1/D2序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中同源序列的搜索(BLAST search)結(jié)果,采用Clustal X軟件將相應(yīng)模式菌株與實(shí)驗(yàn)菌株26S rDNA D1/D2序列進(jìn)行比較分析并選擇典型菌株繪制分子系統(tǒng)樹(shù),其中1072個(gè)菌株與已知模式菌株26S rDNA D1/D2序列相似性在99%以上,被鑒定為37屬56種(圖1)。

圖1　基于26S rDNA D1/D2序列構(gòu)建雁蕩山山脈典型酵母菌株與近緣種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1　The phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 sequences, showing the relationships among representative strains and their close relatives編號(hào)中E、S、W、N和M分別表示該菌株分離自東雁蕩山、南雁蕩山、西雁蕩山、北雁蕩山和中雁蕩山

2.2　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的疑似新種

在雁蕩山山脈分離得到1118個(gè)葉棲酵母菌株中,有46個(gè)菌株26S rDNA D1/D2序列較為特殊,與最近緣的已知種類(lèi)26S rDNA D1/D2序列均存在1%以上的堿基差異,根據(jù)目前國(guó)際酵母菌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[27- 29]疑似屬于新的酵母菌類(lèi)群。其中,分離自北雁蕩山共有23株、中雁蕩山7株、南雁蕩山10株、西雁蕩山2株和東雁蕩山4株。通過(guò)Clustal X軟件比較并與相應(yīng)模式菌株比對(duì),包括子囊菌酵母4屬5種和擔(dān)子菌酵母9屬14種(表1)。

表1　疑似新種與最近緣已知酵母菌模式種26S rDNA D1/D2序列比較

續(xù)表疑似新種Proposednewspecies菌株Strains最近緣模式種(序列號(hào))與相似性/%Closestrelatives(accessionnumber)andsequenceidentity宿主植物Hosts緯度和經(jīng)度Latitudeandlongitude地點(diǎn)SitesColacogloeasp．2N0921C．foliorum(KY106943)96．15Cryptomeriafortunei28°21′47″121°3′59″北雁蕩Colacogloeasp．3N2121C．eucalyptica(EU075184)97．11Schimasuperba28°22′2″121°5′26″北雁蕩Derxomycessp．S0372D．simaoensis(KY107627)97．28Sloaneasinensis27°36′6″120°16′14″南雁蕩S1412Elaeocarpusdecipiens27°35′57″120°16′22″Fellozymasp．N3051F．inositophila(KY107699)93．19Ligustrumsp．28°22′5″121°5′21″北雁蕩S095293．01Phoebechekiangensis27°35′56″120°16′20″南雁蕩Kockovaellasp．S0541K．barringtoniae(AB292854)98．04Camelliaoleifera27°36′4″120°16′11″南雁蕩Kondoasp．1M151K．myxariophila(AF189904)96．10Rosalaevigata？中雁蕩E1511Rhuschinensis27°49′52″121°7′11″東雁蕩E2111Hoveniaacerba27°50′5″121°7′13″E2711Ficuserecta27°50′8″121°7′16″Kondoasp．2S1322K．myxariophila(AF189904)97．37Syzygiumjambos27°35′58″120°12′23″南雁蕩S1512Euonymuscarnosus27°35′57″120°16′22″Saitozymasp．W0951S．flavus(AF075497)91．83Adinarubella28°2′11″120°22′20″西雁蕩N0931Cryptomeriafortunei28°21′47″121°3′59″北雁蕩N0941N0961N0991

2.3　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的分布特征

從雁蕩山山脈分離到的1118株葉棲酵母菌被鑒定為37屬56種已知種類(lèi)和13屬19種疑似新種(圖1和表1)。其中,在東雁蕩山有12種常見(jiàn)類(lèi)群,占該地區(qū)葉棲酵母菌的95.4%；在南雁蕩山有14種常見(jiàn)類(lèi)群,占該地區(qū)葉棲酵母菌的86.8%；在西雁蕩山有9種常見(jiàn)類(lèi)群,占該地區(qū)葉棲酵母菌的94.4%；在北雁蕩山有14種常見(jiàn)類(lèi)群,占該地區(qū)葉棲酵母菌的93.3%；中雁蕩山分離到13種常見(jiàn)種類(lèi),占該地區(qū)葉棲酵母菌的94%(表2)。雁蕩山山脈常見(jiàn)的葉棲酵母菌種類(lèi)中,只有Derxomycesmrakii和Derxomycespseudoschimicola兩種酵母菌在東雁蕩山、西雁蕩山、南雁蕩山、北雁蕩山、中雁蕩山都可以分離到；除北雁蕩山的優(yōu)勢(shì)酵母為Derxomycespseudoschimicola之外,其他地區(qū)分離到的葉棲酵母菌中Derxomycesmrakii均表現(xiàn)出明顯的分布優(yōu)勢(shì)；特別是在東雁蕩山,Derxomycesmrakii在該地區(qū)常見(jiàn)葉棲酵母菌中的相對(duì)頻率可以達(dá)到55% (表2)。

表2　雁蕩山山脈常見(jiàn)葉棲酵母菌的相對(duì)頻率/%

稀有種類(lèi); The rare taxa (RF﹤1%);

東雁蕩山East Yandang mountain:Bulleribasidiumfoliicola,Bulleribasidiumsp.1,Ceraceosorusafricanus,Erythrobasidiumsp.,Hannaellasinensis,Microsporomycesmagnisporus,Naganishiaalbida,Tilletiopsissp.

南雁蕩山South Yandang mountain:Bannoahahajimensis,Chrysozymasp.1,Chrysozymasp.2,Colacogloeafalcata,Colacogloeasp.1,Cystobasidiomycetessp.,Derxomycesboekhoutii,Derxomycessp.,Dioszegiazsoltii,Exobasidiumsymploci-japonicae,Fellozymasp.,Golubeviapallescens,Kockovaellasp.,Kockovaellavietnamensis,Kondoasp.2,Microsporomycesmagnisporus,Microstromaphylloplanum,Nielozymaformosana,Phyllozymacorallina,Rhodotorulasp.,Sporobolomyceskoalae,Sporobolomycespararoseus,Symmetrosporacoprosmae,Takashimellaformosensis.

西雁蕩山West Yandang mountain:Bannoaogasawarensis,Bulleribasidiumsp.2,Cryptococcussp.,Derxomycesbambusicola,Dioszegiazsoltii,Hannaellasurugaensis,Myriangiumsp.,Oberwinklerozymayarrowii,Piskurozymacylindricus,Rhodotorulasp.,Saitozymasp.

北雁蕩山North Yandang mountain:Carlosrosaeasp.,Colacogloeafalcate,Colacogloeasp.2,Colacogloeasp.3,Derxomycesboekhoutii,Fellozymasp.,Meiranashicola,Moesziomycesaphidis,Papiliotremaaurea,Sporobolomyceskoalae.

中雁蕩山Middle Yandang mountain:Collophorasp.,Coniosporiumsp.,Cryptococcussp.,Derxomycesboekhoutii,Dioszegiazsoltii,Gjaerumiaminor,Jaminaeaangkorensis,Kondoasp.1,Oberwinklerozymayarrowii,Papiliotremaaurea,Rhodotorulasp.,Tilletiopsissp.

多樣性指數(shù)(H′)和豐度(R)可以反映該地區(qū)葉棲酵母菌的物種多樣性程度,在雁蕩山山脈廣闊地區(qū)分布的葉棲酵母菌具有豐富的多樣性。從多樣性指數(shù)(H′)來(lái)看,北雁蕩山﹥中雁蕩山﹥南雁蕩山﹥西雁蕩山﹥東雁蕩山；根據(jù)酵母菌的豐度值,也可以看出分離自北雁蕩山、中雁蕩山和南雁蕩山的葉棲酵母菌種類(lèi)相對(duì)更多(表3)。

表3　雁蕩山山脈常見(jiàn)葉棲酵母菌的多樣性指數(shù)(H′)和豐度(R)

相似性系數(shù)可以比較雁蕩山山脈兩個(gè)地區(qū)之間葉棲酵母菌物種組成的相似性程度。根據(jù)表4發(fā)現(xiàn),中雁蕩山常見(jiàn)葉棲酵母菌組成與東、南、西、北雁蕩山等周邊地區(qū)的相似性系數(shù)較高,達(dá)到0.4—0.52；而南雁蕩山與西雁蕩山、中雁蕩山常見(jiàn)葉棲酵母菌組成最為相近,相似性系數(shù)達(dá)到0.52的較高水平；東、西雁蕩山和南、北雁蕩山的葉棲酵母菌種類(lèi)的相似程度則較低,相似性系數(shù)分別為0.19和0.21。

表4　雁蕩山山脈常見(jiàn)葉棲酵母菌的相似性系數(shù)

2.4　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的序列差異

以東雁蕩山、西雁蕩山、南雁蕩山、北雁蕩山和中雁蕩山都可以分離到的Derxomycesmrakii為代表,對(duì)雁蕩山山脈屬于同一種類(lèi)的葉棲酵母菌物種資源D1/D2序列進(jìn)行分析和比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離自雁蕩山山脈的廣布種Derxomycesmrakii包括13種基因型,根據(jù)每種基因型與模式菌株CBS8288的D1/D2序列比較結(jié)果及其在雁蕩山不同地區(qū)分布的相對(duì)頻率(表5),其中與模式菌株D1/D2序列完全相同的基因型01最常見(jiàn),在雁蕩山各個(gè)地區(qū)可以占到Derxomycesmrakii菌株的87.4%—98.2%。

表5　Derxomyces mrakii各種基因型的相對(duì)頻率及其與模式菌株的序列差異/%

2.5　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的物種累積曲線

圖2　雁蕩山山脈葉棲酵母菌的物種累積曲線Fig.2　The species accumulation curves for the yeasts from the Yandang Mountain area1：物種累積曲線；2、3：在95%置信區(qū)間內(nèi)物種累積曲線的下限與上限95%

基于雁蕩山山脈常見(jiàn)葉棲酵母菌在東雁蕩山、西雁蕩山、南雁蕩山、北雁蕩山和中雁蕩山的分布數(shù)據(jù)(表2),采用EstimateS軟件對(duì)該地區(qū)葉棲酵母菌多樣性進(jìn)行了分析和計(jì)算,并繪制出雁蕩山山脈葉棲酵母菌的物種累積曲線(圖2)。

根據(jù)物種累積曲線特征和EstimateS軟件計(jì)算結(jié)果,其Bootstrap值為46.95,估計(jì)在本項(xiàng)研究中已經(jīng)將雁蕩山地區(qū)80.94%的葉棲酵母菌分離出來(lái)。

3　討論

雁蕩山是我國(guó)華東地區(qū)的重要山脈之一,幅員遼闊、資源豐富,在生物多樣性研究方面受到廣泛重視[30]。該地區(qū)溫度、濕度等環(huán)境因子適合野生酵母菌棲息,系統(tǒng)、全面的研究雁蕩山地區(qū)酵母菌資源情況具有一定代表性。在野生酵母菌研究方面,植物葉表是人們比較關(guān)注的酵母菌棲息環(huán)境[31- 32],而且每年秋季的成熟植物葉片上酵母菌的種類(lèi)和數(shù)量最為豐富[33]?，F(xiàn)在一般認(rèn)為,同土壤等生境相比較,葉表可能更容易分離到特殊種類(lèi)的酵母菌。

目前國(guó)際上通行的酵母菌鑒定依據(jù)主要是26S rRNA基因D1/D2區(qū)域的序列組成[23,27],種內(nèi)不同菌株之間D1/D2序列差異應(yīng)該在1%以?xún)?nèi),如果株間該序列堿基差異在1%以上則基本可以判定為不同種類(lèi)[28]。近年來(lái)酵母菌分類(lèi)系統(tǒng)變化較大[34- 36],在進(jìn)行雁蕩山地區(qū)葉棲酵母菌的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí),參照最新的酵母菌分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行了必要的修正。

分離自雁蕩山山脈的1072株葉棲酵母菌,經(jīng)過(guò)26S rRNA基因D1/D2序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析,屬于56個(gè)已知類(lèi)群(圖1)；另外還有46個(gè)菌株26S rDNA D1/D2序列與已知種類(lèi)差異明顯,根據(jù)26S rRNA基因D1/D2序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,基本可以確定這些菌株代表19個(gè)新類(lèi)群(表1)；盡管有些菌株,還需要詳細(xì)研究其ITS序列特征和生理生化特征、細(xì)胞形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以進(jìn)一步證明其新種地位,但是疑似新種比較常見(jiàn)的事實(shí)也說(shuō)明,研究雁蕩山地區(qū)葉棲酵母菌資源具有重要的理論意義。

在雁蕩山地區(qū)有38種常見(jiàn)葉棲酵母菌類(lèi)群(表2),包括Derxomyces屬5種,Sporobolomyces屬3種,Bannoa、Bulleribasidium、Rhodosporidiobolus、Symmetrospora、Taphrina、Tilletiopsi和Udeniomyces屬各2種,Bullera、Coniochaeta、Coniosporium、Cryptococcus、Elsinoe、Erythrobasidium、Fellozyma、Golubevia、Kockovaella、Kondoa、Leucosporidium、Moesziomyces、Oberwinklerozyma、Phyllozyma、Ruinenia和Saitozyma屬各1種,其中Derxomycesmrakii在該地區(qū)分離到的葉棲酵母菌中具有明顯分布優(yōu)勢(shì)。Hamamoto和Nakase[37]最早從新西蘭的三種植物L(fēng)eptospermumscoparium、Nothofagusfusca、Pseudowinteracolonata上分離到Derxomycesmrakii培養(yǎng)物,并將其鑒定為Bullera屬新種,Wang和Bai[38]在建立Derxomyces屬時(shí)將其重合組合在Derxomyces屬中。在分析比較雁蕩山地區(qū)Derxomycesmrakii的D1/D2序列時(shí),發(fā)現(xiàn)大量培養(yǎng)物與模式酵母的序列并非完全一致,表現(xiàn)出一定程度的遺傳多樣性(表5)。

雁蕩山山脈葉棲酵母菌資源豐富(表3),根據(jù)不同地區(qū)常見(jiàn)葉棲酵母菌組成(表2)和相似程度(表4),發(fā)現(xiàn)中雁蕩山與東雁蕩山、西雁蕩山、南雁蕩山和北雁蕩山葉棲酵母菌相似性系數(shù)達(dá)到0.4—0.52,表明中雁蕩山與其他4個(gè)地區(qū)的葉棲酵母菌種類(lèi)組成更加相似；而東、西雁蕩山之間和南、北雁蕩山之間葉棲酵母菌組成相似性系數(shù)分別為0.19和0.21,酵母菌種類(lèi)組成存在更大差異；可能地理上相近地區(qū)的酵母菌物種分布具有更大相似性,這個(gè)推測(cè)可以供今后野生酵母菌資源考察工作參考。

在生物多樣性研究領(lǐng)域,物種累積曲線被廣泛用于樣本量充分性的判斷以及物種豐富程度的估計(jì)[39]。根據(jù)圖2,我們已經(jīng)分離到雁蕩山地區(qū)絕大多數(shù)的葉棲酵母菌種類(lèi),研究結(jié)果可以真實(shí)反映出該地區(qū)葉棲酵母菌資源和物種多樣性的存在狀況。