楊 霄，索紋紋，洪 波，李小玲，曾春芳，黃向榮，3

[1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410153； 2.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)沙)，湖南長(zhǎng)沙 410153；3.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000]

甲基睪酮(methyhestosterone，簡(jiǎn)稱MET)，別稱甲睪酮、甲基睪丸酮、甲基睪丸素，是一種人工合成的雄性激素，具有雄性和蛋白同化雙重作用，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可以提高產(chǎn)量和控制性別[1-2]。甲基睪酮在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，極小的殘留量都會(huì)對(duì)人體造成巨大的潛在危害，因此，多數(shù)國(guó)家已經(jīng)禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用此種激素，并要求動(dòng)物源食品中不得檢出該激素。2001年我國(guó)農(nóng)業(yè)部實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5070—2001《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中，將甲基睪酮列為禁用藥物。2003年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定甲基睪酮為禁用獸藥。

目前，甲基睪酮的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[4]以及酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5]等。HPLC前處理步驟較繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)；ELISA容易出現(xiàn)樣品假陽性，定量不準(zhǔn)確，較適用于樣品初篩；HPLC-MS/MS前處理較簡(jiǎn)單，靈敏度和特異性高，可用于甲基睪酮的準(zhǔn)確定量。水產(chǎn)品中甲基睪酮的前處理方法多為傳統(tǒng)的固相萃取[6-7]、超聲提取-乙酸乙酯反萃取[8]、超聲提取-乙醚反萃取[9]、磁力攪拌-液液分配[10]等，這些方法操作步驟較多，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于大批量樣品的快速測(cè)定。分散固相萃取(Dispersive-SPE)凈化法(QuEChERS)，是由美國(guó)的Lehotay和德國(guó)的Anastassiadas于2003年提出的一種快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、可靠和安全的樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)直接將吸附劑粉末加入提取液中進(jìn)行凈化，其操作簡(jiǎn)便快速，取樣量少，廉價(jià)安全，適合批量樣品的快速分析檢測(cè)。本試驗(yàn)采用QuEChERS方法和HPLC-MS/MS技術(shù)，擬建立一種高效、快速的水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

本試驗(yàn)所用中華鱉、羅非魚、凡納濱對(duì)蝦均購自長(zhǎng)沙市水渡河農(nóng)產(chǎn)品大市場(chǎng)。

TSQ Quantum Access液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；FA25均質(zhì)器(德國(guó)Fluko公司)；精密電子天平(Mettler Toledo公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；漩渦振蕩器(美國(guó)Fisher公司)。

甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司)5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-18 ℃保存，臨用時(shí)稀釋；甲酸(LC-MS級(jí)，美國(guó)Sigma公司)；乙腈(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)；N-丙基乙二胺(N-propylethane-1,2-diamine，簡(jiǎn)稱PSA，百靈威科技有限公司)；C18吸附劑(70～230目，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；無水硫酸鎂(MgSO4，分析純，鄭州益康化工產(chǎn)品有限公司)；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 色譜條件 Atlantis C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.0 μm)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流速為300 μL/min；流動(dòng)相：甲醇+0.1%甲酸水溶液(體積比=70 ∶30)。

1.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測(cè)；噴霧電壓為4 000 V；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；毛細(xì)管溫度為350 ℃；蒸發(fā)溫度為300 ℃；鞘氣壓力為40(arbitrary unit)，輔助氣壓力為10(arbitrary unit)，碰撞氣壓力為199.983 mPa(表1)。

表1 甲基睪酮質(zhì)譜采集參數(shù)

注：“*”標(biāo)記的為定量離子。

1.3 樣品前處理

水產(chǎn)品取可食肌肉部分，按照SC/T 3016—2004《水產(chǎn)品抽樣方法》的規(guī)定處理后置于-18 ℃密封保存。使用前先解凍。

1.3.1 樣品提取 準(zhǔn)確稱取(5±0.02) g處理后的樣品于 50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈，同時(shí)加入3.0 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩提取1 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液于雞心瓶中。向下層殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并2次的上清液于雞心瓶中。于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。

1.3.2 樣品凈化 在雞心瓶中加入2 mL流動(dòng)相充分溶解殘?jiān)?，? mL復(fù)溶液轉(zhuǎn)入裝有50 mg PSA、150 mg C18吸附劑的5 mL離心管中，充分漩渦振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min后，取上清液過0.22 μm聚四氟乙烯膜后上機(jī)測(cè)定。

1.4 校準(zhǔn)曲線的繪制

將空白樣品按照“1.3”節(jié)方法處理后，取適量空白上清液加入不同量的甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成1、5、10、50、100、200 ng/mL的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后進(jìn)樣。以待測(cè)物提取離子流色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)、相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇 本試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯4種溶劑的提取效果。結(jié)果表明，以上4種溶劑對(duì)甲基睪酮的提取效率均較高，達(dá)到75%以上。甲醇能溶解大多數(shù)極性物質(zhì)，乙酸乙酯提取的親脂性化合物較多，二者共萃取雜質(zhì)多，易造成基質(zhì)干擾，而乙腈、乙醚樣品提取液較清澈，基質(zhì)干擾較小，且目標(biāo)物周圍無明顯的雜質(zhì)干擾峰，但乙醚易揮發(fā)、毒性大，對(duì)試驗(yàn)操作者影響大，故本試驗(yàn)選擇毒性較小、揮發(fā)性低的乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 無機(jī)鹽用量的選擇 水產(chǎn)品中含有不同量的水分，且水分與乙腈互溶，在目標(biāo)化合物被乙腈提取的過程中部分水相分配到乙腈提取層，影響試驗(yàn)結(jié)果和下一步分離操作。因而需要加入合適的無機(jī)鹽去除有機(jī)相的水分。本試驗(yàn)根據(jù)Schenck等的報(bào)道[11]，選用無水MgSO4作為除水劑。試驗(yàn)比較了不同量的無水MgSO4對(duì)除水效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)無水MgSO4用量為3 g時(shí)可以有效除去水分，回收率較高；當(dāng)無水MgSO4用量少于2 g時(shí)，不能完全除去有機(jī)相的水分，造成樣品濃度稀釋，導(dǎo)致回收率降低；當(dāng)無水MgSO4用量為5 g時(shí)，過量的無機(jī)鹽將目標(biāo)化合物部分包埋，使待測(cè)物未完全進(jìn)入乙腈提取相，從而降低了回收率(圖1)。因此，本試驗(yàn)選用 3 g 無水MgSO4作為除水劑。

2.1.3 分散固相萃取條件的優(yōu)化 樣品經(jīng)過乙腈沉淀蛋白質(zhì)后已經(jīng)去除了大部分的干擾物，但仍可能存在少量的色素、脂肪等雜質(zhì)，為了提高凈化效率和減少待測(cè)物的損失，本試驗(yàn)采用分散固相萃取的凈化手段。PSA作為凈化吸附劑可以除去樣品基質(zhì)中的少量極性色素、有機(jī)酸、酚類和糖類，C18吸附劑可以除去一些強(qiáng)疏水性干擾物(如脂肪)。由于魚蝦樣品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪以及一些色素等干擾物質(zhì)，所以本試驗(yàn)采用PSA和C18作為吸附劑進(jìn)行分散固相萃取凈化。本試驗(yàn)在5份1 mL空白魚肉提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后，再分別加入不同比例的PSA和C18，得到甲基睪酮的加標(biāo)回收率。從圖2可以看出，當(dāng)PSA、C18質(zhì)量比=100 mg/50 mg時(shí)，甲基睪酮的回收率最低，表明PSA對(duì)甲基睪酮有一定程度的吸附作用，因此可以適當(dāng)降低PSA的比例。當(dāng)PSA、C18質(zhì)量比=50 mg/150 mg時(shí)，甲基睪酮的空白魚肉提取液較清澈，甲基睪酮回收率在85%以上，說明該比例的PSA和C18對(duì)目標(biāo)物的吸附少且可以很好地吸附脂肪、色素等雜質(zhì)，樣品提取液凈化效果好。當(dāng)C18的使用比例繼續(xù)增加時(shí)，無明顯效果，且隨著吸附劑的增加，上清液的量逐漸減少，不方便移取，因此，本試驗(yàn)選取PSA、C18質(zhì)量比=50 mg/100 mg作為分散固相萃取吸附劑的用量。

2.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成影響目標(biāo)化合物的峰型、保留時(shí)間及質(zhì)譜的離子化效率[6]。液質(zhì)聯(lián)用的流動(dòng)相組成為甲醇-水體系和乙腈-水體系。本試驗(yàn)選用甲醇和乙腈作為有機(jī)相，水、0.1% 甲酸水溶液、2 mmol/L乙酸銨水溶液、2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為水相，進(jìn)行不同組合。結(jié)果表明，以甲醇和0.1%甲酸水溶液(體積比為7 ∶3)作為流動(dòng)相組成時(shí)目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度最大，峰型最尖銳，且目標(biāo)化合物周圍無明顯雜質(zhì)峰干擾。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵進(jìn)樣的方式，以5 μL/min的流速，將 500 ng/mL 甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在正離子模式下對(duì)甲基睪酮進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到分子離子，然后以分子離子為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，以SRM模式進(jìn)行檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上對(duì)碰撞能等離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度比例最佳。最終確定“1.2.2”節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

在液相色譜-質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應(yīng)是客觀存在的?；|(zhì)效應(yīng)影響測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。為了消除(或補(bǔ)償)基質(zhì)效應(yīng)給分析結(jié)果帶來的偏差，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)，稀釋樣品溶液，配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以及優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件等方法。本試驗(yàn)采用優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件和配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2.5 線性范圍與檢出限

在選定的色譜分離條件和質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)下，將6個(gè)濃度系列的甲基睪酮空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，結(jié)果表明，在 1～200 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，甲基睪酮的色譜峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=473 540x-132 48，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。50 ng/mL甲基睪酮空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM色譜結(jié)果如圖3所示。采用空白樣品添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.3”節(jié)方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定，根據(jù)特征離子色譜峰的信噪比(S/N值)等于3為檢出限，S/N值等于10為定量限，得到甲基睪酮的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為 1.0 μg/kg。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

根據(jù)水產(chǎn)品各物種間肌肉成分的差異，如蝦肉中的色素含量較高，中華鱉肌肉中脂肪含量較高等，選取羅非魚、中華鱉以及凡納濱對(duì)蝦3類水產(chǎn)品的肌肉組織進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。各個(gè)品種空白樣品的添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為1、10、50 μg/kg，每個(gè)濃度水平作平行樣品5個(gè)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。4種樣品的加標(biāo)回收率為82.4%～96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.21%～6.98%，表明該方法的準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，符合藥物殘留檢測(cè)方法的要求。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

將建立的方法用于30份市售水產(chǎn)品(10份草魚，10份羅非魚，5份凡納濱對(duì)蝦，5份中華鱉)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這30份市售水產(chǎn)品中均未檢出甲基睪酮，說明上述市售水產(chǎn)品中未違規(guī)添加甲基睪酮。

表2 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康姆椒?。采用分散固相萃取技術(shù)，有機(jī)試劑用量少，樣品前處理簡(jiǎn)單，易于操作；采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，顯著縮短了色譜分析時(shí)間，提高了靈敏度。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、高效、環(huán)保的特點(diǎn)，適合當(dāng)前水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅靠焖贆z測(cè)的要求。