洪宇航

(西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615000)

中華絨鰲蟹(Eriochiersinensis)又稱河蟹、大閘蟹，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)特有的淡水養(yǎng)殖蟹類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著養(yǎng)殖年份的增加，養(yǎng)殖模式更加多元化，其中種養(yǎng)結(jié)合的養(yǎng)殖模式已在長(zhǎng)江流域、遼河流域大面積推廣[1]。稻田養(yǎng)蟹是一種高效又經(jīng)濟(jì)的立體生態(tài)種養(yǎng)技術(shù)模式，把水稻種植業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有效地結(jié)合起來(lái)，發(fā)揮各自的積極作用，充分利用整個(gè)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量，以獲得水稻、河蟹雙豐收[2]。稻田養(yǎng)蟹技術(shù)從開發(fā)推廣至今已有30多年歷程，但是一直存在著水稻施藥與河蟹增產(chǎn)的矛盾[3]。草甘膦是美國(guó)孟山都公司研發(fā)生產(chǎn)的一種高效廣譜滅生性除草劑，由于其水溶性好，效果快，目前在世界各國(guó)被普遍使用于農(nóng)田、果園、養(yǎng)殖水體中的雜草清除，主要通過(guò)直接噴灑或地表徑流影響附近水體水生生物[4]。目前，國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于草甘膦對(duì)水生生物安全的研究報(bào)道，如對(duì)于藻類、水蚤、魚類以及蝦蟹類等[5-7]，但其對(duì)于甲殼類動(dòng)物的毒性作用卻少見報(bào)道，對(duì)我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類——中華絨螯蟹的影響的報(bào)道僅有1例，其主要探究了草甘膦對(duì)于中華絨螯蟹幼蟹的毒性[8]，而針對(duì)成蟹的研究尚未見報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同濃度梯度草甘膦水體，研究其對(duì)中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標(biāo)，包括總血細(xì)胞密度(THC)、血清中血藍(lán)蛋白含量、酚氧化酶(PO)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性、堿性磷酸酶(AKP)活性的影響，初步探究草甘膦脅迫下中華絨螯蟹成蟹的免疫應(yīng)答情況，從而為草甘膦在稻蟹種養(yǎng)及常規(guī)養(yǎng)殖池塘除草過(guò)程中的使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)動(dòng)物中華絨螯蟹成蟹采自江蘇省金壇市水產(chǎn)技術(shù)推廣站養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)于2016年9月至11月在西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。試驗(yàn)前在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d以上，24 h氣泵增氧，每日2次投喂人工配合飼料。挑選身體健康、大小均勻的中華絨螯蟹用于試驗(yàn)，雌雄各占50%，平均質(zhì)量(107±13.45) g。將中華絨螯蟹隨機(jī)放入125 cm×60 cm×60 cm水族缸箱中，每箱10只，箱中加入經(jīng)曝氣1 d以上的自來(lái)水50 L，箱底放置經(jīng)消毒處理的PVC管作為遮蔽物。光暗周期12 h ∶12 h，試驗(yàn)期間每日09：00至19：00投喂人工配合飼料，并于投餌后3 h檢查吃食情況，清理糞便和殘餌。試驗(yàn)期間每日測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)，保證水溫(20±2)℃、pH值 7.2～7.8、溶氧量>5 mg/L、氨態(tài)氮含量<0.5 mg/L、亞硝酸鹽含量 <0.15 mg/L。

1.2 濃度梯度設(shè)計(jì)

草甘膦異丙胺鹽水劑(有效成分41%)，購(gòu)自浙江省美豐農(nóng)化有限公司。參考草甘膦在中華絨螯蟹幼蟹毒性試驗(yàn)中的濃度[8]和其他水生動(dòng)物毒性試驗(yàn)中的濃度[5-7]，以及草甘膦在稻田水體中的殘留和消解情況[5]，設(shè)置1.90、4.10、6.30、8.50、10.70 mg/L 5個(gè)濃度組以及1個(gè)0 mg/L空白對(duì)照組。每組中華絨螯蟹30只，設(shè)置3個(gè)平行，分別放置于3個(gè)水族箱中。試驗(yàn)采用48 h半靜水法，每12 h換水1次，并配置相同濃度草甘膦溶液以保證試驗(yàn)水體濃度不變。分別于3、6、12、24、48 h觀察并記錄中華絨螯蟹的存活情況，每組任意取5只蟹取血淋巴用于免疫指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 分析測(cè)定

1.3.1 存活率測(cè)定 試驗(yàn)開始后3、6、12、24、48 h觀察中華絨螯蟹存活情況，以觸碰眼柄無(wú)反應(yīng)，撈出后1 min仍無(wú)活動(dòng)能力判定為死亡。觀察每個(gè)觀察點(diǎn)并記錄。

1.3.2 THC測(cè)定 每個(gè)觀察點(diǎn)取中華絨螯蟹，第5步足基膜處抽取血淋巴100 μL，加入等量抗凝劑(0.1 mol/L葡萄糖、0.14 mol/L氯化鈉、30 mmol/L檸檬酸、10 mmol/L EDTA、pH值=4.6)混勻，立即采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.3.3 血藍(lán)蛋白濃度檢測(cè) 每個(gè)觀察點(diǎn)取中華絨螯蟹，盡可能多抽取血淋巴至2 mL離心管，立即放置于-4 ℃冰箱4 h以上。11 000 r/min 4 ℃高速冷凍離心30 min，用移液槍小心取上清(血清)于2 mL離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ{(lán)蛋白含量的測(cè)定參考章躍陵等的方法[9]進(jìn)行改良，用血藍(lán)蛋白稀釋液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L CaCl2、pH值=8.0)對(duì)中華絨螯蟹血清進(jìn)行100倍稀釋，分光光度計(jì)測(cè)定334 nm下吸光度，根據(jù)Lambert-Beer定律，血藍(lán)蛋白濃度：C=D/(EL)(D為吸光度、E為消光系數(shù)、L為比色皿厚度)，本試驗(yàn)采用 1 cm 比色皿，按E334nm=2.3 nm計(jì)算血藍(lán)蛋白濃度(mg/mL)。

1.3.4 PO活性測(cè)定 血清制備方法同“1.3.3”節(jié)，PO活性的測(cè)定參考Ashida的方法[10]，將50 μL 3 g/LL-dopa、50 μL血清以及50 μL PBS緩沖液(0.1 mol/L、pH值7.0)加入96孔板中，在室溫下混勻孵育20 min，490 nm波長(zhǎng)下讀取起始和10 min時(shí)的吸光度(D490 nm)，以10 min內(nèi)每分鐘吸光度增加0.001為1個(gè)酶活力單位(U)計(jì)算。

1.3.5 ACP活性測(cè)定 血清制備方法同“1.3.3”節(jié)，ACP活性測(cè)定方法遵照ACP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(江蘇南京建成生物科技有限公司)，使用Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。酶活性最終數(shù)據(jù)統(tǒng)一換算為國(guó)際單位(U/L)。

1.3.6 AKP活性測(cè)定 血清制備方法同“1.3.3”節(jié)，AKP活性測(cè)定方法遵照AKP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(江蘇南京建成生物科技有限公司)，使用Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。酶活性最終數(shù)據(jù)統(tǒng)一換算為國(guó)際單位(U/L)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，不滿足齊性方差時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根處理，采用ANOVA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較，在GraphPad Prism 5上繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹成蟹存活的影響

試驗(yàn)期間，除最高濃度10.70 mg/L組外，其他各組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。10.70 mg/L組在24 h出現(xiàn)1只死亡，48 h出現(xiàn)3只死亡，48 h死亡率僅為13.3%

2.2 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹成蟹THC的影響

從圖1可以看出，中華絨螯蟹成蟹THC正常值約為(6.98±0.24)×106個(gè)/mL，各組THC隨著攻毒時(shí)間延長(zhǎng)而上升，且有隨著濃度提高增加幅度加大的趨勢(shì)，隨后各組均有所恢復(fù)。其中8.50 mg/L組增長(zhǎng)幅度最大，并于6 h達(dá)到峰值，顯著高于其他各組。10.70 mg/L組THC最初也有所上升，并在12 h達(dá)到最大值，但在24 h時(shí)出現(xiàn)了下降的情況，并低于0 h正常水平，在48 h顯著低于其他各組。

2.3 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹血清血藍(lán)蛋白含量的影響

從圖2可以看出，隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度草甘膦各組血清血藍(lán)蛋白濃度均出現(xiàn)先下降再恢復(fù)回升的趨勢(shì)。且隨著濃度的增加，下降趨勢(shì)越明顯。其中8.50 mg/L組下降最多，在12 h達(dá)到最低值。在6、12 h，8.50、10.70 mg/L 組血藍(lán)蛋白水平均顯著低于其他4組。至48 h 1.90、4.10 mg/L組基本恢復(fù)到正常水平，與空白組差異不顯著，而其他3組均顯著低于空白組。

2.4 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹血清PO活性的影響

從圖3可以看出，各濃度組血清PO活性均有所上升。其中最高濃度10.70 mg/L組上升最為明顯，在3 h時(shí)即達(dá)到最大值，約為0 h正常水平的3.7倍，顯著高于其他各組；隨后有所下降，但在6 h仍顯著高于其他各組；在12 h時(shí)有明顯下降，隨后繼續(xù)下降，至48 h仍顯著高于空白組。相比之下，低濃度組變化幅度不大，除12 h外，其他各組在各時(shí)間點(diǎn)均同空白組無(wú)顯著性差異。

2.5 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹血清ACP活性的影響

各濃度組血清ACP活性隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而下降，其中10.70 mg/L較其他組下降最為明顯，12 h時(shí)降至最低值，且在試驗(yàn)后不同時(shí)間段均顯著低于其他各組。8.50 mg/L組下降幅度其次，3 h時(shí)并未有明顯下降，至6 h較前3組顯著降低，此后有所恢復(fù)。而1.90 mg/L組ACP活性起初雖有減低，但在各時(shí)間段與空白組均無(wú)顯著差異(圖4)。

2.6 草甘膦對(duì)中華絨螯蟹血清AKP活性的影響

各濃度組AKP活性均呈下降趨勢(shì)，特別是8.50、10.70 mg/L 組，在3 h檢測(cè)時(shí)便有明顯下降，顯著低于對(duì)照組以及其他3個(gè)濃度組；10.70 mg/L組在6 h時(shí)降至最低水平，僅有(18.42±2.14) U/L，并在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于空白組及低濃度組(圖5)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，草甘膦作為常用廣譜滅生性除草劑，在國(guó)內(nèi)被廣泛使用，包括稻蟹共作的稻田以及空心蓮子草和水葫蘆叢生的養(yǎng)殖池塘等。草甘膦通過(guò)直接施加入水以及地表徑流影響附近河流、湖泊，關(guān)于其對(duì)水生生物的毒性及安全評(píng)估有較多報(bào)道。傅建煒等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草甘膦對(duì)草魚、鰱魚和鯽魚96 h LC50分別為0.251 8、0.258 8、0.259 9 mg/L，均屬于高毒農(nóng)藥[6]；劉曉偉等研究了草甘膦對(duì)多刺裸腹蚤的急性毒性作用，認(rèn)為草甘膦對(duì)多刺裸腹蚤為低毒[11]；朱國(guó)念等的研究指出，草甘膦對(duì)麥穗魚、蚤狀蚤和斜生柵藻均屬于低毒[5]，而關(guān)于草甘膦對(duì)蝦蟹類的毒性研究則鮮有報(bào)道。史建華等研究了草甘膦對(duì)中華絨螯蟹幼蟹急性和慢性毒性，結(jié)論為草甘膦對(duì)中華絨螯蟹幼蟹毒性屬于低毒，安全濃度為 1.9 mg/L[8]。但其并沒(méi)有研究草甘膦對(duì)于中華絨螯蟹成蟹的影響。在草甘膦對(duì)水體環(huán)境安全性研究中，有學(xué)者指出，在施用草甘膦后，養(yǎng)殖池塘水體草甘膦殘留量當(dāng)日為 6.286 mg/L，施藥后1 d下降90%左右，至施藥后6 d降至 0.003 mg/L，消失十分迅速；而在魚塘沉積物中檢測(cè)的殘留濃度則較高，1 d后仍高達(dá)2.835 mg/L[5]，這對(duì)于依賴底質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的蝦蟹類動(dòng)物十分不利。目前，已有研究表明，草甘膦對(duì)于蝦蟹類，包括日本蟳[7]、克氏原螯蝦[12]、中華絨螯蟹幼蟹[8]等均屬于低毒。因此，草甘膦對(duì)于主要經(jīng)濟(jì)蝦蟹類的毒性作用，包括是否能顯著影響其免疫功能，造成應(yīng)激脅迫而誘發(fā)疾病的爆發(fā)，成為后續(xù)研究的重點(diǎn)。筆者參考草甘膦對(duì)于中華絨螯蟹幼蟹的安全濃度以及在水體中當(dāng)日殘留濃度，設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)濃度，檢測(cè)不同濃度草甘膦對(duì)于中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標(biāo)的影響，為后續(xù)毒理機(jī)制和安全施藥提供理論依據(jù)。

血淋巴細(xì)胞在甲殼動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于非常關(guān)鍵的地位，血細(xì)胞總數(shù)可以間接反映出動(dòng)物機(jī)體的健康狀態(tài)及免疫應(yīng)激能力，因此經(jīng)常作為衡量甲殼類動(dòng)物免疫水平的指標(biāo)之一[13]。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度草甘膦作用下各組中華絨螯蟹THC均有所升高，隨著濃度的增加，升高的趨勢(shì)也越明顯。其中8.50 mg/L組上升最明顯，6 h時(shí)達(dá)到峰值。濃度為10.70 mg/L組在24 h時(shí)出現(xiàn)下降。在Cu2+對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦毒性研究中，低濃度Cu2+(0.05、0.5 mg/L)下斑節(jié)對(duì)蝦THC出現(xiàn)了上升，而高濃度(1.5、3.5 mg/L)組則造成THC顯著下降，與本研究結(jié)果相似[14]。Gallo等研究表明，對(duì)螳螂蝦注射微球菌后，其THC在1 h內(nèi)顯著上升，并在3 h有明顯回落[15]。而本研究在對(duì)健康中華絨螯蟹成蟹注射一定量嗜水氣單孢菌后，注射組較空白組和生理鹽水組THC有明顯上升，在6 h時(shí)達(dá)到最高，然后逐漸恢復(fù)。本研究認(rèn)為，低濃度草甘膦可以刺激中華絨螯蟹機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其THC水平升高以應(yīng)對(duì)應(yīng)激脅迫。相反高濃度草甘膦則會(huì)對(duì)免疫功能產(chǎn)生抑制作用，致使THC水平下降。

血藍(lán)蛋白分散在機(jī)體的血淋巴中，是甲殼類動(dòng)物的呼吸色素，不僅具有輸氧和免疫防御功能，還與其他理化調(diào)節(jié)有關(guān)，是一種多功能蛋白[9]。本研究表明，不同濃度草甘膦下中華絨螯蟹血藍(lán)蛋白含量均出現(xiàn)不同程度減少，且減少程度與草甘膦濃度大致呈正相關(guān)。本結(jié)果與Yoganandhan等研究中印度對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后血藍(lán)蛋白含量明顯減少結(jié)果[16]一致。此外，樂(lè)亞玲研究表明，高濃度銅綠微囊藻可以引起克氏原螯蝦血清血藍(lán)蛋白含量在1 h明顯上升，隨后劇烈下降至顯著低于正常水平，并在5 h達(dá)到最低值[17]。表明低毒濃度下的草甘膦也能造成中華絨螯蟹血清中血藍(lán)蛋白的分解，從而降低了其輸氧和免疫防御的功能。

中華絨螯蟹體液中不具有免疫球蛋白，酚氧化酶(PO)作為其體液免疫主體之一，是抵御外界不利環(huán)境的第一道防線，與機(jī)體的免疫有直接的關(guān)系[18]。結(jié)果表明，各濃度草甘膦作用下中華絨螯蟹機(jī)體內(nèi)PO活性都有明顯增強(qiáng)，其中最高濃度組增幅最為明顯，并于3 h達(dá)到最高值，隨后下降。這與陸宏達(dá)等報(bào)道中不同刺激造成機(jī)體PO活性增強(qiáng)的結(jié)果[19]相似。此外，Dong等在dsRNA攻毒中華絨螯蟹的研究中證實(shí)，GFP-dsRNA作用下中華絨螯蟹血淋巴PO活性于6 h時(shí)顯著升高并達(dá)到峰值[20]；Xian等研究表明，0.5 mg/L Cu2+作用下斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴PO活性會(huì)有所上升，同樣在6 h時(shí)升至最高[14]。因此，筆者推測(cè)高濃度草甘膦可以激活中華絨螯蟹酚氧化酶系統(tǒng)，引起血淋巴中PO活性顯著上升，而作用時(shí)間在1～6 h之間，這可能也是多數(shù)甲殼動(dòng)物酚氧化酶系統(tǒng)激活的時(shí)間范圍。

ACP、AKP是甲殼動(dòng)物體內(nèi)一組重要的水解酶，在甲殼動(dòng)物免疫應(yīng)答中起到重要作用。本研究中中華絨螯蟹ACP活性低濃度組出現(xiàn)略微上升，而高濃度組出現(xiàn)下降；AKP則各濃度組均出現(xiàn)下降，且隨著濃度升高愈加明顯。與Zhao等在組織胺對(duì)中華絨螯蟹免疫影響研究中的結(jié)論[21]相同。不同濃度組織胺注射后，在6 h均引起中華絨螯蟹血清中ACP、AKP活性顯著下降。然而，這一結(jié)論同王洪斌等在草甘膦對(duì)日本蟳毒性脅迫的研究中所得到的ACP、AKP有明顯上升的結(jié)論[7]相悖。這可能是物種差異造成的，具體原因有待進(jìn)一步分析。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，中華絨螯蟹成蟹對(duì)于草甘膦的耐受能力遠(yuǎn)強(qiáng)于幼蟹，在接近幼蟹48 h半致死濃度的10.70 mg/L濃度下，僅出現(xiàn)13%死亡率。但通過(guò)檢測(cè)中華絨螯蟹各項(xiàng)免疫指標(biāo)，筆者發(fā)現(xiàn)即使在幼蟹1.90 mg/L安全濃度下，仍對(duì)其免疫產(chǎn)生不良影響，特別是AKP活性仍在各時(shí)段顯著降低。且隨著藥物濃度升高，對(duì)各項(xiàng)免疫指標(biāo)影響更大。因此，雖然草甘膦在較低濃度下不會(huì)直接造成中華絨螯蟹的死亡，但是會(huì)對(duì)其免疫功能造成影響，尤其是在高溫天氣、水質(zhì)惡化等情況下增大病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，加大了發(fā)病概率。此外，在高濃度(達(dá)到8.50 mg/L以上)草甘膦作用下，中華絨螯蟹各項(xiàng)免疫指標(biāo)在48 h仍未恢復(fù)至正常水平，表明即使在非致死濃度下，草甘膦可48 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間對(duì)中華絨螯蟹的免疫系統(tǒng)造成影響。鑒于此筆者建議在養(yǎng)蟹水體應(yīng)避免使用草甘膦。