賀 江 李曉月 仇玉潔 李博恩 楊品紅

(1. 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2. 環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖與加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 常德 415000；3. 湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000)

中國作為世界上著名的水產(chǎn)品養(yǎng)殖、生產(chǎn)和出口大國，水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界2/3，而漁藥殘留問題一直都是各方關(guān)注的焦點(diǎn)。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolone，F(xiàn)Qs)是一類十分重要的人工合成抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、組織穿透力強(qiáng)、價格低廉、與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)[1]，曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。但不合理的用藥可導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物及其代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)品中的殘留，進(jìn)而引起食用者腸道菌群失衡或產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性作用及潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用[2-3]。近年來，隨著社會對食品安全問題關(guān)注度逐漸增大，氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域的應(yīng)用開始受到限制，或制定了相應(yīng)的最大殘留限量(MRL)。歐盟和北美等國家早已在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用環(huán)丙沙星，中國也在NY 5070—2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》和NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》中將其列為禁用藥物。中國農(nóng)業(yè)部于2015年又發(fā)布了第2292號公告，禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種氟喹諾酮類藥物在食用動物中的使用。歐盟及中國規(guī)定水產(chǎn)品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的最高殘留總限量為100 μg/kg。

建立方便有效的殘留檢測方法，是加強(qiáng)水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留監(jiān)控的前提與基礎(chǔ)。目前，文獻(xiàn)報(bào)道中已有一系列的關(guān)于喹諾酮類藥物的檢測方法，如免疫分析法[4-5]、毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]等。其中HPLC方法相對來說最普遍，但其在靈敏度和檢測效率上仍存在不足。超高效液相色譜技術(shù)(UPLC)是一種較傳統(tǒng)HPLC方法更加靈敏和快速的分析方法，隨著該技術(shù)的發(fā)展和普及，極有望替代HPLC成為新一代食品安全檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。此外，在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中，樣品前處理的傳統(tǒng)方法多為液液萃取法，不僅復(fù)雜耗時而且精確度不高；而固相萃取(SPE)技術(shù)已在食品安全檢測中廣泛應(yīng)用。本研究旨在基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)，建立可同時測定水產(chǎn)品中諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星6種氟喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法，為水產(chǎn)品的安全提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚：市售；

氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國A ChemTek公司；

Cleanert PEP-2固相萃取柱：填料量200 mg，體積6 mL，博納艾杰爾公司；

乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；

磷酸二氫鉀、檸檬酸、乙酸銨、磷酸等：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀(配有FLR熒光檢測器): Acquity H-Class型，美國Waters公司；

液相色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(1.76 μm，2.1 mm×50.0 mm)，美國Water公司；

高速冷凍離心機(jī): Multifuge X1R型，賽默飛世爾科技中國有限公司；

固相萃取裝置: DG-24型， 美國Supelco公司；

電子分析天平: TX223L型, 日本島津公司；

氮吹儀: HAD-24B型，北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法與步驟

1.3.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

(1) UPLC分析條件的優(yōu)化：配置濃度均為500 ng/mL的6種氟喹諾酮藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定進(jìn)樣體積為0.2 μL，柱溫為50 ℃，檢測波長為λex=278 nm，λem=465 nm。參考有關(guān)文獻(xiàn)資料[11-14]，重點(diǎn)對流動相的類型和流速進(jìn)行優(yōu)化，以獲取最佳檢測效果。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：按照表1用乙腈分別配制氟喹諾酮系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用已確定的UPLC分析檢測條件進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 6種氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制Table 1 Preparation of mixed standard solution of six fluoroquinolones

1.3.2 水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

(1) 固相萃取小柱的效果驗(yàn)證：將2 mL濃度為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬提取液過SPE小柱(用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化)，再用3 mL 5%甲醇水淋洗，最后用6 mL甲醇洗脫。分別收集上樣過柱液、淋洗液、洗脫液，各取1 mL過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測其中各種氟喹諾酮類藥物的含量，以驗(yàn)證所用固相萃取柱的效果。

(2) 提取方案的選擇：準(zhǔn)確稱取5 g經(jīng)攪碎的魚肉樣品(并做加標(biāo)處理)，分別加入10 mL酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.5)4種不同溶劑，渦旋混勻1 min后超聲波(40 kHz, 50 W)提取10 min，再于10 000 r/min離心10 min 取上清液，重復(fù)提取3次。合并提取液，按上述SPE操作進(jìn)行凈化，洗脫液經(jīng)氮吹濃縮至干后，殘?jiān)?.2%的甲酸水溶液溶解后過0.22 μm濾膜供UPLC分析。

1.3.3 方法評價

(1) 添加回收試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)：按照表2所示A、B、C 3組不同的添加水平，在空白基質(zhì)魚肉中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平重復(fù)3次，同時做空白試驗(yàn)。按照所優(yōu)化的方案進(jìn)行前處理，再用所建立的UPLC方法檢測氟喹諾酮藥物的含量。用添加回收率評價方法的準(zhǔn)確度，用多次檢測的添加回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價方法的精密度。

(2) 最低檢出限和最低定量限試驗(yàn)：參照美國EPA標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的單濃度重復(fù)試驗(yàn)方法進(jìn)行最低檢出限和最低定量限的測定[15]。

1.3.4 市售水產(chǎn)樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測 按照1.3.1 和1.3.2所優(yōu)化的色譜方法和前處理方法，分別對某超市采購的草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚進(jìn)行氟喹諾酮類藥物檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

氟喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)上有羧基和哌嗪基，具有酸堿兩性，又由于分子結(jié)構(gòu)相似，給液相色譜分離帶來一定的難度。根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道，為防止色譜峰拖尾，通常選用酸性溶液如檸檬酸、乙酸銨、乙腈、甲醇、三乙胺等多種配比作為流動相。在本試驗(yàn)條件下，嘗試采用多種流動相配比和流速。最終結(jié)果表明：以體積比為93∶7的0.05 mol/L 檸檬酸+0.1 mol/L 乙酸銨緩沖液-乙腈為流動相，流速為0.42 mL/min 時，在Waters Acquity UPLC?BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm×50.0 mm)上10 min內(nèi)將6種氟喹諾酮類藥物有效分開(圖1)，與傳統(tǒng)的HPLC方法相比，檢測效率明顯提高。以此色譜條件，分析1.3.1中氟喹諾酮系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到6種氟喹諾酮藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、決定系數(shù)R2和線性范圍見表3。

2.2 水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

2.2.1 固相萃取小柱的效果驗(yàn)證 固相萃取柱應(yīng)用效果的影響因素除填料類型外，也包括填料的粒徑以及填料裝填的緊密程度等，因此不同品牌的同一類型固相萃取柱也可能會產(chǎn)生不同的效果。本研究用標(biāo)準(zhǔn)溶液作為模擬樣品，對所選用的Cleanert PEP-2固相萃取小柱進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。結(jié)果表明，上樣過柱液、淋洗液中均未檢出6種氟喹諾酮，而洗脫液中6種氟喹諾酮類藥物的含量與預(yù)期基本相符，回收率為95.9%～100.7%(表4)，說明選用的固相萃取柱有效。

表2 添加回收試驗(yàn)中6種氟奎諾酮類藥物的 添加水平設(shè)置Table 2 Spiking levels of six fluoroquinolones in recovery test μg/kg

諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星濃度為160 ng/mL；培氟沙星濃度為40 ng/mL；恩諾沙星濃度為80 ng/mL

圖1 6種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Figure 1 UPLC chromatogram of six kinds of fluoroquinolones standard表3 6種氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍Table 3 Standard curve equation and linear range of six kinds of fluoroquinolones

表4固相萃取過程中各部分收集液中6種氟喹諾酮類藥物的含量及回收率?

Table 4 Concentration and recovery of six kinds of fluoroquinolones in different part of solution during SPE process (n=3)

藥物名稱含量/(ng·mL-1)上樣過柱液a淋洗液洗脫液b回收率/%諾氟沙星未檢出未檢出166.77100.1氧氟沙星未檢出未檢出159.9095.9環(huán)丙沙星未檢出未檢出164.5698.7培氟沙星未檢出未檢出162.2297.3洛美沙星未檢出未檢出167.88100.7恩諾沙星未檢出未檢出161.1496.7

? a. 將2 mL濃度均為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬樣品進(jìn)行上樣； b. 洗脫液體積為6 mL。

2.2.2 提取方案的選擇 樣品前處理過程中不同的提取劑的提取能力有很大差異，目前常用的提取劑主要有酸性乙腈[16]、磷酸鹽緩沖液[17]、鹽酸[18]、二氯甲烷[19]等水溶液或有機(jī)溶劑。為了最大效率提取樣品中6種氟喹諾酮類藥物，本研究比較了酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=4.5) 4種提取溶劑的提取效果，結(jié)果見表5。使用酸化乙腈提取時，樣品蛋白質(zhì)極易快速沉淀，造成待測物包裹損失，提取效果不佳；使用1 mol/L的鹽酸溶液提取時，提取液中脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較高，后續(xù)凈化過程中易堵塞固相萃取柱；而四丁基溴化銨和磷酸鹽緩沖液提取時效果較好。綜合考慮，選用磷酸鹽緩沖溶液(pH 4.5)作為最終的提取溶劑。

2.3 方法評價

在確定UPLC分析條件和水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物提取、凈化等前處理方案的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對整套檢測方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度進(jìn)行了評價，結(jié)果見表6。由表6可知，6種氟喹諾酮藥物的添加回收率為63.69%～90.83%，最低檢出限為0.5～1.8 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%，表明方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范食品理化檢測》的相關(guān)要求。

2.4 市售魚樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測

按照1.3.1和1.3.2所優(yōu)化的色譜方法和前處理方法，對常德市區(qū)某超市出售的草魚、鳊魚、鯽魚、黃古魚4種水產(chǎn)品進(jìn)行了6種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，相關(guān)色譜圖見圖2。結(jié)果表明：諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星5種禁用藥物在4種水產(chǎn)品中均未檢出；恩諾沙星在草魚、鳊魚、鯽魚中有檢出，黃古魚中未檢出，其中草魚中的殘留量低于檢測方法的最低定量限，鳊魚和鯽魚的殘留量分別為5.158，7.083 μg/kg，也均低于恩諾沙星在水產(chǎn)品肌肉中的最大殘留限量(100 μg/kg)。

表5 不同提取劑提取效果的比較Table 5 Comparison of extraction effects of different extractants

表6 水產(chǎn)品6種氟喹諾酮類藥物檢測分析方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度評價結(jié)果Table 6 The accuracy, precision, and sensitivity of the analysis methods for 6 kind of fluoroquinolones in aquatic products (n=3)

圖2 4種魚中氟喹諾酮類藥物殘留檢測色譜圖Figure 2 UPLC chromatogram of fluoroquinolones determination in grass carpa

3 結(jié)論

本研究基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)建立了水產(chǎn)品中的6種氟喹諾酮藥物殘留的檢測方法，并利用該方法對4種常見的市售水產(chǎn)品進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該方法的前處理過程簡單有效，上機(jī)分析過程較傳統(tǒng)的HPLC分析耗時明顯縮短(10 min即可完成分析)；靈敏度明顯提高(最低檢出限為0.5～1.8 μg/kg)；準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性符合檢測要求，添加回收率為63.69%～90.83%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%。綜合說明，該方法有望為氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)分析方法的建立提供借鑒和參考。