陳虹兆，張晗晗，許　凱，徐　燕，紀(jì)德華，王文磊，陳昌生，謝潮添

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0　引言

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是一種大型經(jīng)濟(jì)海藻，主產(chǎn)于我國福建省、浙江省和廣東省。壇紫菜的生活史是異型世代交替的，兩個世代都具有獨立生活能力，其葉狀體世代是單倍體，附生在中高潮區(qū)的巖石；其絲狀體世代是二倍體，生活在貝殼內(nèi)部[1-3]。很多水生生物都受到紫外輻射 (ultroviolet radiation,UVR)的影響，海洋中的浮游動物和一些微藻可以調(diào)節(jié)所處的水深來躲避UVR，但壇紫菜等大型海藻不能遷移以避免UVR的傷害。因此，壇紫菜的葉狀體天然暴露在紫外輻射之中，并且隨著退潮，藻體直接暴露在高劑量的UVR之下。UVR可以破壞生物的DNA，具有誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧和損傷細(xì)胞膜等多種負(fù)面影響[4-5]。紫菜可以通過合成紫外吸收物質(zhì)來抵御紫外輻射的傷害[6-9]，但這些研究只關(guān)注對葉狀體世代的影響。壇紫菜不同世代所處的紫外輻射環(huán)境差異巨大，有必要研究其紫外輻射耐受和調(diào)控機(jī)制方面的世代差異。

在很多海洋和淡水生物中，類菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids，MAAs)是最常見的紫外吸收物質(zhì)(UV absorbing compounds)[4]。MAAs是一類水溶性的含氮色素復(fù)合物，分子量較低，基本結(jié)構(gòu)是環(huán)己烯酮。MAAs能夠與多種氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)，種類與結(jié)合的氨基酸有直接的關(guān)系。20世紀(jì)70年代，MAAs首次在真菌中發(fā)現(xiàn)，許多種微藻和大型海藻均含有種類豐富的MAAs[7]。MAAs能吸收紫外波段的范圍是309～362 nm(主要處于紫外A(UVA，315～400 nm )波段)，也吸收少量紫外B(UVB，280～315 nm)波段[4,7]。文獻(xiàn)[6-8]報道紫菜等大型海洋紅藻含有較高含量的MAAs，用于抵御紫外線的傷害作用。

紫外輻射增強可導(dǎo)致活性氧含量增加，而MAAs還具有清除活性氧的功能。Matsui等[10]在念珠藻的研究中發(fā)現(xiàn)MAAs能清除活性氧自由基。高溫脅迫誘使柱狀珊瑚(Stylophorapistillata)活性氧自由基含量增加，但過氧化物酶系統(tǒng)的水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，而一種具有抗氧化功能的MAAs的含量卻增加了近20倍[11]。生物通過莽草酸途徑合成MAAs，其關(guān)鍵步驟是7-磷酸景天庚酮糖在3-脫氫奎寧酸合酶(DHQS)的催化下生成MAAs的前體3-脫氫奎寧酸[7,12]。因此DHQS被認(rèn)為是MAAs合成過程中的關(guān)鍵酶，而其編碼基因aroB基因是合成MAAs的關(guān)鍵基因。DHQS的編碼基因aroB在多種微藻中已被成功克隆，如魚腥藻、藍(lán)藻等[13-14]。但壇紫菜相關(guān)基因的克隆還未見報道。本研究的目的是要在壇紫菜轉(zhuǎn)錄組學(xué)的基礎(chǔ)上，對壇紫菜的aroB基因進(jìn)行全長克隆，并通過實時熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)測定該基因在不同世代的表達(dá)特征，為進(jìn)一步解析壇紫菜的紫外輻射耐受和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　藻株來源和培養(yǎng)

實驗選用的壇紫菜品系為Z-61，由集美大學(xué)選育。絲狀體來源于壇紫菜種質(zhì)資源庫。取少量絲狀體經(jīng)29 ℃促熟后，在21 ℃下充氣促放殼孢子，然后萌發(fā)成葉狀體。葉狀體和絲狀體均為充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度21 ℃，光照強度50 ～ 60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，每3天更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為營養(yǎng)鹽加富的天然海水，營養(yǎng)鹽濃度參考Provasoli’s enrichment solution(PES)。均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2　MAAs相對含量測定

MAAs的提取方法參考文獻(xiàn)[15-16]，本研究稍有優(yōu)化。先將藻體經(jīng)液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中低溫凍干36 h，粉碎至40目。然后，加入25%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，在60 ℃水浴鍋中溫育15 min。 冷卻至室溫后，以8000 r/min冷凍離心15 min?；謴?fù)至室溫后，在紫外分光光度計上測定250～800 nm之間的吸收，其吸收峰位于333 nm處。樣品的總蛋白含量用試劑盒測定。每個梯度處理樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，2個技術(shù)重復(fù)。

MAAs濃度的計算公式：CMAAs=A/(ε·Cpr)，其中A為333 nm下的吸光度值，ε為消光系數(shù)4 mL/(km·mg),Cpr為樣品的總蛋白含量。

1.3　引物及其序列

本研究中基因的全長克隆、驗證、陽性克隆篩選及基因表達(dá)水平定量分析所采用的引物序列設(shè)計如表1所示，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

表1　實驗中所用引物的名稱和序列

1.4　總RNA的提取及質(zhì)量檢測

收集壇紫菜藻體0.1 g，吸干表面水分，在液氮中研磨后，用E.Z.N.A 植物 RNA 提取試劑盒(OMEGA，德國)提取總RNA。經(jīng)凝膠電泳檢查提取的總RNA的完整性，并在紫外分光光度計上分別測定260 mm和280 nm處的吸光值，根據(jù)測定結(jié)果計算RNA的濃度，判斷核酸和蛋白質(zhì)的污染情況。

1.5　基因的全長克隆及驗證

根據(jù)壇紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫Unigene的注釋結(jié)果，選取注釋結(jié)果為3-脫氫奎寧酸羧化酶/O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的Unigene0013975作為PharoB-1基因全長克隆的核心序列,選取注釋結(jié)果為3-脫氫奎寧酸羧化酶基因的Unigene0010955作為PharoB-2基因全長克隆的核心序列。測序后，根據(jù)獲得的5′和3′序列與核心序列的重疊區(qū)，用DNAMAN 5.2.2(Lynnon BioSoft)拼接，獲得兩條基因的全長序列。然后，根據(jù)拼接的全長序列，設(shè)計head to toe引物，以RACE擴(kuò)增時獲得的cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、轉(zhuǎn)化和測序，并將測序結(jié)果與拼接結(jié)果進(jìn)行比對，以驗證全長克隆的正確性。

1.6　基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的BlastN程序?qū)寺〉玫降娜L基因序列進(jìn)行序列同源性檢測。用ORF Finder軟件分析基因的開放閱讀框(ORF)和所編碼的氨基酸序列。用PROSITE、InterProScan和PrediSi查找基因序列的保守位點和信號肽序列。用Clustal X進(jìn)行氨基酸多重序列比對，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7　實時熒光定量PCR

根據(jù)基因序列設(shè)計qPCR正反向引物，以UBC基因作為內(nèi)參，分析兩條基因在不同世代的表達(dá)差異。提取的總RNA按PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa，大連)的說明書進(jìn)行操作。熒光定量PCR擴(kuò)增在ABI7300型定量PCR儀上進(jìn)行。以10×梯度稀釋的cDNA為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次反應(yīng)都設(shè)置陰性對照和無模板對照，每個反應(yīng)設(shè)3個平行復(fù)孔。

1.8　數(shù)據(jù)分析

采用t-test分析數(shù)據(jù)的差異比較均值：P>0.05為差異不顯著；P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1　不同生活史世代間MAAs含量測定分析

壇紫菜葉狀體世代的MAAs含量顯著高于絲狀體世代，約為絲狀體世代的6倍(見圖1)。

2.2　壇紫菜紫外吸收物質(zhì)相關(guān)基因的全長克隆

從壇紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出各相關(guān)基因的核心序列，采用普通PCR和5′/3′RACE相結(jié)合的方法，克隆基因的全長。序列經(jīng)過測序和拼接后，最終獲得2條基因的全長，一是壇紫菜3-脫氫奎寧酸羧化酶/O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PharoB-1)，另一是3-脫氫奎寧酸羧化酶基因(PharoB-2)，這些序列均已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫中，結(jié)果如表2所示。

表2　壇紫菜MAAs合成基因的克隆

2.3　MAAs合成相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

基因PharoB-1的克隆以Unigene0013975為基礎(chǔ)，經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增獲得了1900 bp的序列，然后以之為核心序列設(shè)計了4個特異引物來克隆PharoB-1的部分cDNA。用SMART RACE技術(shù)獲得了5′端780 bp的cDNA片段(見圖2a)和3′端315 bp的cDNA片段(見圖2c)。將以上3個片段拼接，獲得了全長為3003 bp 的cDNA片段。為了驗證PharoB-1的全長，分別以cDNA 和gDNA為模板，用一對head to toe引物來擴(kuò)增PharoB-1。擴(kuò)增結(jié)果包括了1條3003 bp 的片段(見圖2d，圖2e)，其與克隆序列長度一致。全長序列已經(jīng)提交給GenBank，收錄號為KT380133?；騊haroB-2的克隆以壇紫菜Unigene001095序列作為核心序列，設(shè)計普通PCR引物擴(kuò)增中間片段，得到1條長度為1049 bp的序列。根據(jù)所得序列，設(shè)計特異性引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增和測序，獲得1條長度為303 bp的5′-末端序列(見圖2f)和1條長度為838 bp的3′-末端序列(見圖2i)。對兩條末端序列和中間片段進(jìn)行拼接，獲得了1條長度為1496 bp的全長序列，經(jīng)過全長序列驗證(見圖2j)和Blast比對，確認(rèn)其為壇紫菜的aroB基因，命名為PharoB-2。將其與以gDNA為模板擴(kuò)增出的全長序列(圖2k)比較，顯示長度均為1496 bp，堿基序列沒有差異。

利用在線軟件Swiss-Model對PhDHQS-2氨基酸序列的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。

PharoB-1所編碼蛋白為DHQS和O-轉(zhuǎn)甲基酶(O-MT)的聚合酶即PhDHQS-OMT，所以選擇同樣有該聚合蛋白的海洋尖尾藻進(jìn)行多重比對分析(結(jié)果見圖4)。

ORF finder分析顯示PharoB-1 cDNA 包括位于5′端的275 bp的非翻譯區(qū)和3′端的79 bp的非翻譯區(qū)，以及2649 bp 的開放閱讀框(ORF)。這個 ORF編碼1條882個氨基酸的蛋白多肽，其分子量為95.72 ku。基因編碼的蛋白序列含有47個磷酸化位點，其中絲氨酸28個，蘇氨酸11個，酪氨酸8個。

Predictprotein程序預(yù)測PharoB-1所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中構(gòu)成螺旋、片層和環(huán)狀的氨基酸殘基分別占總氨基酸殘基的比例為39.23%、16.44%和44.33%(見圖2a)。采用ORF Finder軟件對PharoB-2基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因序列2～1441個堿基為完整的ORF，可編碼包含479個氨基酸，分子量為49.30 ku?；蚓幋a的蛋白包含18個磷酸化位點，其中絲氨酸8個，蘇氨酸10個。Predictprotein程序預(yù)測PharoB-2所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中構(gòu)成螺旋、片層和環(huán)狀的氨基酸殘基分別占總氨基酸殘基的比例為37.37%、20.25%和42.38%。

如圖4所示，壇紫菜中PhDHQS-1與海洋尖尾藻中的蛋白序列相似度較高。兩序列中均含有兩個不同的保守功能域(單/雙上劃線部分)，DHQS保守功能域在前，O-MT在后，且DHQS酶中均有若干個活性位點，用陰影標(biāo)出。DHQS蛋白氨基酸序列的多重序列比對結(jié)果表明，所克隆的PharoB-2基因?qū)儆贒HQS基因家族，且與棉屬植物中DHQS蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，序列相似性較高(見圖5)。

2.4　紫外吸收物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的定量分析

與MAAs合成相關(guān)的基因PharoB，在不同世代間表達(dá)量存在顯著差異。其中PharoB-1基因在葉狀體中表達(dá)量約為絲狀體中的300倍(見圖6a，P<0.001)，而PharoB-2基因在葉狀體世代約為絲狀體世代的4倍(見圖6b，P<0.01)。

2.5　PhDHQS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分為明顯的兩支：微藻與高等植物。PhDHQS-1(PhDHQS-OMT)與大多數(shù)微藻聚為一支，而PhDHQS-2與高等植物聚類為另一分支(見圖7)。說明壇紫菜中兩條DHQS分屬于不同分支，PhDHQS-1與微藻類親緣關(guān)系更近，而PhDHQS-2則與高等植物親緣關(guān)系較近。

3　討論

紫外輻射(UVR)是太陽輻射的一部分，因此藻類在利用光能進(jìn)行光合作用的同時，不可避免地受到UVR的影響。UVR對各種光合藻類有多方面的傷害作用，而經(jīng)濟(jì)海藻壇紫菜應(yīng)答UVR的機(jī)制以及世代差異還不清楚。一些具有游泳能力的微藻可以通過垂直遷移來躲避UVR的傷害[4-5]。而包括壇紫菜在內(nèi)的大型海藻不能通過遷移以避免輻射傷害，只能增強其抵御UVR傷害的機(jī)制。很多生物通過產(chǎn)生紫外吸收物質(zhì)來抵御UVR的傷害。研究表明，紫菜可以通過合成紫外吸收物質(zhì)來抵御UVR的傷害[6-8]。紫外吸收物質(zhì)種類很多，其中類菌孢素氨基酸(MAAs)是最常見的紫外吸收物質(zhì)。退潮時，壇紫菜葉狀體直接暴露在UVR下，而貝殼可以使UVA和UVB分別衰減約50%和75%[17]。因此，壇紫菜絲狀體世代和葉狀體世代所處的UVR環(huán)境差異巨大。本研究重點關(guān)注壇紫菜MAAs含量的世代差異，以及相關(guān)合成基因的世代表達(dá)差異。

本研究發(fā)現(xiàn)MAAs在葉狀體中的含量顯著高于絲狀體。PharoB是MAAs合成的關(guān)鍵基因，葉狀體中兩條PharoB基因的表達(dá)量也顯著高于絲狀體。這種差異極可能與壇紫菜不同世代的棲息環(huán)境相關(guān)。楊頂田等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，藻類通過MAAs含量的增加來抵御UVB，這是長期進(jìn)化后表現(xiàn)出的適應(yīng)現(xiàn)象。另外，UVR會誘導(dǎo)銅綠微囊藻大量合成MAAs，從而增加其耐受UVR的能力[18]。Corcora等[19]研究發(fā)現(xiàn)大型海藻受UVB影響產(chǎn)生的紫外吸收物質(zhì)能有效地保護(hù)潮間帶生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)其他生物的生存。然而，過量的UVB會導(dǎo)致藻體受到氧化損傷[5]。牛美英[20]和應(yīng)銳等[21]分別發(fā)現(xiàn)麒麟菜和條斑紫菜的MAAs提取物具有抗氧化活性。壇紫菜絲狀體生長于貝殼中，不僅UVR被貝殼減弱，而且可見光也降低了約40%[17]。此外，有研究認(rèn)為MAAs合成需要可見光[22]，這可能也是葉狀體中MAAs含量及PharoB基因表達(dá)量均顯著高于絲狀體的原因。

在模式生物藍(lán)藻中，DHQS酶是MAAs合成的關(guān)鍵酶[14]。在經(jīng)濟(jì)海藻條斑紫菜的功能基因組研究中，王孟強[23]研究發(fā)現(xiàn)MAAs合成過程中的關(guān)鍵酶為aroB基因編碼的DHQS/O-MT。而壇紫菜與條斑紫菜親緣關(guān)系較近。本研究以轉(zhuǎn)錄組測序獲得的DHQS/O-MT unigene序列作為核心序列，采用普通PCR和RACE擴(kuò)增技術(shù)成功克隆了2條編碼壇紫菜DHQS酶的基因aroB，分別命名為PharoB-1、PharoB-2。通過序列多重比對發(fā)現(xiàn)PharoB-1基因的ORF功能結(jié)構(gòu)域中，存在兩個酶的編碼序列，分別為DHQS酶和O-轉(zhuǎn)甲基酶(O-MT)。而PharoB-2只編碼DHQS酶，沒有編碼O-MT的結(jié)構(gòu)域。這導(dǎo)致了系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示2條PhDHQS蛋白分為明顯的2支，相距較遠(yuǎn)。2條PhDHQS蛋白分別與微藻和高等植物的親緣關(guān)系更近(見圖7)，這也與紅藻的進(jìn)化地位一致。

綜上所述，壇紫菜葉狀體世代的紫外吸收物質(zhì)MAAs含量明顯高于絲狀體世代，并且MAAs合成的2條關(guān)鍵基因的表達(dá)與生理數(shù)據(jù)一致，這種差異來源于對不同世代所處的UVR環(huán)境的適應(yīng)。