談 歡 劉玉匯,* 李麗霞 王 麗 李元銘 張俊蓮,*

1 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 / 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅蘭州 730070;

2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070

花色素苷是一類以花色基元為基本結(jié)構(gòu)的水溶性色素, 主要分為飛燕草色素、芍藥色素和天竺葵色素等[1]。它們不僅可以使植物呈現(xiàn)出不同的色彩,還有助于昆蟲的傳粉、植物生長素的運(yùn)輸以及保護(hù)葉片免受紫外線損傷, 同時(shí)具有抑制病蟲害等重要的作用。此外, 它還具有抗癌、抗氧化等保健作用和藥用價(jià)值[2], 因此近年來備受人們的關(guān)注。

花色素苷是類黃酮類次生代謝物質(zhì), 合成前體為苯丙氨酸。苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸裂解酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥基化酶(F3H)、黃烷酮-3'-羥基化酶(F3'H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、花色素苷合成酶(ANS)或無色花色素雙加氧酶(LDOX)形成不穩(wěn)定的花色素苷, 再經(jīng)類黃酮3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)催化生成穩(wěn)定的花色素苷[3-4]。研究證實(shí), 參與花色素苷合成的調(diào)控因子包括R2R3 MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白三大類轉(zhuǎn)錄因子, 其中R2R3 MYB為最重要的轉(zhuǎn)錄因子, 其調(diào)控花色素苷合成已在蘋果和葡萄上證實(shí)[5-6]。R2R3 MYB中R2和R3基序能夠特異性識別DNA序列, R3 C端的螺旋結(jié)構(gòu)能特異結(jié)合目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件中的核心序列[7]。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控花器官發(fā)育和激素應(yīng)答等[8-9],其最重要的功能是調(diào)節(jié)類黃酮和花色素苷的合成。

R2R3 MYB蛋白調(diào)控植物花色素苷的合成已在果樹[10]、小麥[11]、擬南芥[12]、甘蔗[13]等植物中報(bào)道, 例如, 蘋果R2R3 MYB蛋白中的MdMYB10使DFR基因表達(dá)量上調(diào)[14], MdMYBA使ANS的轉(zhuǎn)錄水平提高[15], MdMYB1激活結(jié)構(gòu)基因UFGT和DFR,從而提高了蘋果花色素苷的含量[16]; 油桃中分離的MYB10能夠正向調(diào)控DFR基因的表達(dá), 促進(jìn)花青素在果實(shí)中大量積累[17]; 擬南芥 AtMYB75轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色素苷的生物合成, 其異位表達(dá)促進(jìn)類黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá), 導(dǎo)致植物的大多數(shù)器官呈現(xiàn)紫色[18-20]。

馬鈴薯中有 117個(gè) MYB類轉(zhuǎn)錄因子, 其中R2R3型MYB數(shù)量最多, 它參與植物次生代謝調(diào)控、激素刺激和環(huán)境脅迫應(yīng)答等過程[21], R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控馬鈴薯薯皮和葉片中花色素苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá), 從而促進(jìn)花色素苷的積累[22-23]。生物或非生物因素均能影響花色素苷的生物合成,光照強(qiáng)度與StCHS、StDFR和StR2R3-MYB的表達(dá)正相關(guān); 環(huán)境溫度與StPAL、StDFR和StR2R3-MYB的表達(dá)負(fù)相關(guān)[24-28]。本試驗(yàn)以彩色四倍體馬鈴薯為研究對象, 分離了3個(gè)馬鈴薯R2R3 MYB基因, 并以煙草為受體進(jìn)行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化, 利用 qPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草葉片中與花色素苷合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)分析, 并分析 3個(gè)同源基因的功能。本研究為進(jìn)一步探究馬鈴薯塊莖花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制以及人工調(diào)控馬鈴薯塊莖花色素苷合成提供理論和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

馬鈴薯品種 “新大坪”(XD: 白皮白肉)、“黑美人”(HM: 紫皮紫肉)、“甘農(nóng)薯5號”(GN: 紅皮白肉)和“青薯9號”(QS: 紅皮白肉, 紅色的維管束), 均在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)種植。其中 GN由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)培育, HM和XD是甘肅省當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N, QS由青海省農(nóng)林科學(xué)院培育。分別在塊莖收獲期采集 4個(gè)品種薯皮和薯肉, 立即放入液氮速凍, 于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ吧蜔煵萦筛拭C省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞和 pGEM-T Easy Vector載體(抗性標(biāo)記為氨芐青霉素)購自 Promega公司; 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司; PureLink Plant RNA Reagent Kit購自 Invitrogen公司; QuantiTect Reverse Transcription Kit購自Qiagen公司; DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根公司; 其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 3個(gè)StAN1基因編碼序列的克隆

將已報(bào)道的馬鈴薯StAN1的基因序列(AY841129)作為參考序列[29], 利用Oligo6設(shè)計(jì)引物StAN1-F (5′-ATGAGTACTCCTATGATGTGTA- 3′)和StAN1-R (5′-CTAATTAAGTAGATTCCATATATC-3′),克隆4個(gè)品種StAN1基因的編碼序列。用PureLink Plant RNA Reagent Kit試劑盒分別抽提4種馬鈴薯薯皮薯肉的總RNA。用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermofisher公司, 美國)測定 RNA純度和濃度, 并用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。利用QuantiTect Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 其中以O(shè)ligo(dT)20為引物, 在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第1鏈, 并在–20℃下保存。

PCR反應(yīng)體系是由cDNA模板2 μL、10×buffer 2.5 μL、10 mmol L–1的上下游引物各 1 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL組成。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性50 s, 57℃退火50 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

將擴(kuò)增得到的目的片段用瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化, 并分別與 pGEM-T Easy Vector載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 對所獲得的白斑通過滯后質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增、EcoR I酶切鑒定后, 于–80℃下保存, 并將陽性克隆送到生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。

1.3 馬鈴薯 StAN1轉(zhuǎn)錄因子家族成員的生物信息學(xué)分析

用在線軟件 Expasy (http://au.expasy.org/tools/)中提供的ProtParam和ProtScale分別進(jìn)行蛋白質(zhì)分子式、分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)和氨基酸親疏水性的分析, 用 SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用在線分析軟件InterPro: protein sequence analysis & classification(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行保守性功能域分析。

以StAN1-R0為參比序列, 通過NCBI在線比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 找出與其同源性較高的其他物種的氨基酸序列, 通過Clustal X2和 DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對, 利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法共轉(zhuǎn)化煙草及表達(dá)分析

利用EcoR I酶切位點(diǎn)將StAN13個(gè)同源基因的全長片段重組到植物表達(dá)載體pSAK277中, 再將構(gòu)建體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法[30]將StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因轉(zhuǎn)化到野生型煙草中, 通過 Kan抗性篩選和顏色判定初步篩選陽性抗性苗。根據(jù)特異性引物(F1: 5′-GGCCACATATC AAGAGAGGTGACTTTG-3′, R1: 3′-TCACATCGTT AGCTGTCCTTCCTGG-5′)對所對應(yīng)的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定, 分別用1.5%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物, 根據(jù)鑒定結(jié)果最終獲得轉(zhuǎn)StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因的煙草株系分別為6、9和7株。

1.5 利用qPCR分析轉(zhuǎn)基因煙草中MYB基因的相對表達(dá)

分別提取轉(zhuǎn)StAN1-R0、 StAN1-R1和StAN1-R3基因煙草葉片的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為qPCR擴(kuò)增模板, 根據(jù)特異性設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)。以NtEF-1α基因(序列號為 D63396)為內(nèi)參, 在Mx3005p型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系包含濃度為 50 ng μL–1的 cDNA 2.0 μL、上下游引物 0.4 μL、Nuclease-Free Water 7.2 μL 和 GoTaqqPCR Master Mix 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 95℃變性5 s, 60℃退火5 s, 72℃延伸10 s,循環(huán) 40次。每個(gè)樣品重復(fù) 3次, 反應(yīng)結(jié)束后采用2–ΔΔCT[31]法分析數(shù)據(jù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草中花色素苷平均含量的分析

將不同轉(zhuǎn)基因煙草葉片樣品在液氮中充分研磨,取0.5 g轉(zhuǎn)至5 mL的離心管, 加入酸性甲醇提取液至滿管, 混勻, 4℃下黑暗放置24 h, 離心, 上清液轉(zhuǎn)入 25 mL的容量瓶, 殘?jiān)屑尤胨嵝约状继崛∫?懸浮混勻, 4℃下黑暗放置12 h, 離心取上清液。重復(fù)以上步驟 1次, 最后將浸提液定容至 25 mL。在400～800 nm 可見光的波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光吸收光譜的掃描, 確定其在可見光區(qū)的最大吸收波長。取1 mL花色苷提取液, 分別加入pH 1.0氯化鉀緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液9 mL, 室溫平衡1 h,蒸餾水做空白對照, 分別在λmax和λ700下測定吸光值,代入公式計(jì)算花色素苷總含量[32-33], 最后求其花色素苷含量平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 StAN1基因序列的克隆和分析

從圖1可以看出, 總RNA的28S和18S條帶完整、清晰, 表明RNA的完整性良好。

以cDNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增, 從4個(gè)馬鈴薯品種的薯皮和薯肉中分別獲得了長度為735、777和837 bp的完整片段(圖2)。根據(jù)C端10個(gè)氨基酸序列組成的重復(fù)結(jié)構(gòu)(R: TIAPQPQEGI)數(shù)目的不同(圖3), 分別命名為StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3(GenBank登錄號依次為AKA95391、AKA95392和AKA95392)。其中在WS中含有StAN1-R0, WF中含有StAN1-R1; PS和PF只含有StAN1-R1; RS1、RS2、WF1、WF2和WFV中含有StAN1-R3。序列比對分析發(fā)現(xiàn)這 3個(gè)序列間的同源性達(dá)到 88.85%。StAN1-R0、StAN1-R1、StAN1-R3與參考序列(AY841129)的同源性分別為 87.98%、94.57%和90.29%;StAN1-R0與StAN1-R1、StAN1-R3的同源性分別為 89.15%和 82.37%;StAN1-R1與StAN1-R3的同源性為89.57%, 二者同源性最高。

表1 定量PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR in this study

圖1 總RNA的電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of the total RNA

2.2 馬鈴薯StAN1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 馬鈴薯StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線工具ExPASy中的ProtParam預(yù)測馬鈴薯StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu), 蛋白質(zhì)分子式分別為 C1227H1936N362O365S14、C1284H2019N377 O390S15和 C1371H2164N402O423S15, 分子量分別為28 047.91、29 458.35和 31 527.60 Da。等電點(diǎn)(pI)分別為8.39、6.90和6.14, 等電點(diǎn)的差異表明, 3個(gè)同源基因與其他植物的MYB基因在編碼蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、功能或者調(diào)控方式上有所差異[34]。3個(gè)蛋白質(zhì)分別有負(fù)電荷殘基(Asp+Glu) 30、32和34個(gè), 正電荷殘基(Arg+Lys) 33、32和32個(gè)。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不

圖2 基因克隆過程的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR map of gene cloning

圖3 序列比對圖Fig. 3 Sequence comparison chart

穩(wěn)定系數(shù)(II)分別為46.97、48.64和50.76, 平均疏水性(GRAVY)分別為-0.693、-0.720 和-0.712, 脂肪系數(shù)分別為(AI)為79.14、74.88和76.15。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)均大于40, 三者表現(xiàn)為不穩(wěn)定狀態(tài)[35](表2)。

2.2.2 馬鈴薯StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性/親水性的預(yù)測和分析 蛋白質(zhì)的疏水性可根據(jù)蛋白質(zhì)的平均疏水性(GRAVY)值來預(yù)測, 當(dāng) GRAVY 大于 0時(shí), 為疏水蛋白; 當(dāng)GRAVY小于0時(shí), 為親水蛋白[36]。

根據(jù) ProtScale軟件預(yù)測, 三者的平均疏水性GRAVY均小于0 (表2), 故推測馬鈴薯R2R3 MYB蛋白均為親水蛋白。

2.2.3 馬鈴薯StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析 根據(jù)SOPMA軟件預(yù)測, 3種馬鈴薯StAN1基因編碼的蛋白質(zhì)均由α-螺旋、β-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成。3個(gè)蛋白均為無規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-螺旋(表 3)。

表2 馬鈴薯StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 2 Primary structure prediction of potato StAN1 gene encoding proteins

表3 StAN1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 Secondary structure analysis of StAN1 gene encoding protein (%)

2.2.4 馬鈴薯StANI-R0、StANI-R1和StANI-R3氨基酸同源性分析 多重序列比對結(jié)果顯示, 這 3個(gè)同源基因的編碼區(qū)均含高度保守的R2和R3 MYB結(jié)構(gòu)域, 分別由48個(gè)和46個(gè)氨基酸組成, 該結(jié)構(gòu)域與來自茄科植物和其他科屬植物 MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域具有很高的同源性(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 與StAN1-R0智利番茄和多毛番茄同源基因相似性最高, 同源性為 53.0%; 與單子葉植物玉米和水稻同源基因相似性較低, 分別為33.2%和29.3% (圖5)。

2.2.5 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草的鑒定及其花色素苷平均含量的分析 轉(zhuǎn)目的基因StAN1的煙草葉片顏色呈現(xiàn)紅色, 而CK的葉片為綠色, 轉(zhuǎn)基因煙草的葉片和葉脈顏色深度分別為StAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3(圖 6-a, b)。對轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行目的基因的PCR鑒定, 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) 3個(gè)目的基因已成功轉(zhuǎn)入野生型煙草中(圖7)。分別取轉(zhuǎn)StAN1基因煙草和CK各3個(gè)株系的葉片測定花色素苷的含量發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因煙草葉片的花色素苷含量均明顯高于CK, 且3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草之間的花色素苷含量差異顯著(圖 8),轉(zhuǎn)StAN1-R1煙草葉片中花色素苷平均含量最高, 為

124.46 mg g–1FW,StAN1-R3中平均含量最低, 為89.51 mg g–1FW, 與表型相一致。

2.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草中花色素苷合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析 從圖9-A可以看出, 外源基因StAN1在轉(zhuǎn)基因煙草中顯著上調(diào)表達(dá), 且 3個(gè)基因的表達(dá)量之間無顯著差異, 而在對照煙草中檢測不到StAN1, 進(jìn)一步說明外源基因StAN1已導(dǎo)入到煙草中。與 CK相比, 轉(zhuǎn)StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因煙草中參與花色素苷合成的相關(guān)基因表達(dá)量大幅上調(diào),包括合成途徑中的早期表達(dá)基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3’H和晚期表達(dá)基因NtDFR、NtANS、NtUFGT。其中NtDFR和NtANS在轉(zhuǎn)StAN1-R1煙草中的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)StAN1-R0和StAN1-R3煙草中的。此外, 與CK相比, 轉(zhuǎn)StAN1-R0,StAN1-R1和StAN1-R3煙草葉片中內(nèi)源 NtbHLH轉(zhuǎn)錄因子(NtAN1a和NtAN1b)的相對表達(dá)量均大幅度上調(diào)(圖9-B～I(xiàn)), 說明 3個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)入顯著增強(qiáng)了NtbHLH基因的表達(dá), 其中StAN1-R1對其調(diào)控能力最強(qiáng), StAN1-R3的調(diào)控能力最弱, StAN1-R0的調(diào)控能力介于兩者之間。

圖4 一些茄科植物與其他科屬植物的R2R3 MYB氨基酸序列多重比對Fig. 4 Multiple alignment of amino acid sequence of R2R3 MYB in some solanaceae plants and other subfamily

3 討論

四倍體馬鈴薯的栽培種遺傳背景復(fù)雜, 不同品種的彩色馬鈴薯所合成花色素苷的種類和數(shù)量也不同。MYB是參與調(diào)控植物花色素苷合成中涉及最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子, 研究者已在多種植物中克隆分離出大量的與花色素苷合成積累有關(guān)的 MYB轉(zhuǎn)錄因子,且對其研究較為深入[37]。植物 MYB蛋白的結(jié)構(gòu)域高度保守, 該結(jié)構(gòu)域通常包括 1～4個(gè)重復(fù)的氨基酸R基序, 根據(jù)R基序的數(shù)量分為R1 MYB蛋白、R2R3 MYB蛋白、R1R2R3 MYB蛋白和4R MYB蛋白[10],其中R2R3 MYB在參與調(diào)控不同植物以及同種植物不同組織器官中的花色素苷合成與積累中尤為重要[38]。研究發(fā)現(xiàn), 在馬鈴薯紅色薯皮和紫色薯皮中表達(dá)的基因D是二倍體馬鈴薯薯皮花色素苷合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因, 其編碼 R2R3 MYB-StAN1轉(zhuǎn)錄因子[25]。StAN1不僅調(diào)控薯皮顏色, 而且與 StJAF13轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控馬鈴薯紅葉品種“Magenta Love”的葉片

顏色; 在另一個(gè)紅葉品種‘Double Fun’中, StbHLH1轉(zhuǎn)錄因子與StAN1和StJAF13共同調(diào)控葉片顏色[23]。

圖5 StAN1基因與一些茄科和其他植物R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of StAN1 genes and some R2R3 MYB transcription factor families in solanaceae and other plants

圖6 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草的表型分析Fig. 6 Phenotypic analysis of StAN1 transgenic tobaccoa: 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草的整株; b: 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草的葉片。a: whole plant of StAN1 transgenic tobacco; b: leaves of StAN1 transgenic tobacco.

圖7 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草的PCR鑒定Fig. 7 PCR identification of StAN1 transgenic tobacco

圖8 轉(zhuǎn)StAN1基因煙草與對照的花色素苷平均含量Fig. 8 Average content of anthocyanin in StAN1 transgenictobacco and control

本實(shí)驗(yàn)從不同顏色的四倍體馬鈴薯塊莖中克隆分離了StAN1的 3個(gè)同源基因, 通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)其區(qū)別在于 C末端 3個(gè)重復(fù)序列數(shù)目(R)不同,根據(jù) R數(shù)目分別命名為StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3。通過進(jìn)一步轉(zhuǎn)化煙草分析發(fā)現(xiàn),StAN1-R0、StAN1-R1以及StAN1-R3均顯著調(diào)控?zé)煵萑~片花色素苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因, 使煙草葉片明顯積累花色素苷從而呈現(xiàn)紅色, 其中含有一個(gè)重復(fù)序列R的StAN1-R1調(diào)控能力最強(qiáng), 煙草葉片呈現(xiàn)深紅色, 花色素苷含量積累最多, StAN1-R3調(diào)控能力最弱, 說明R在StAN1調(diào)控花色素苷能力方面具有重要功能。

另有研究表明, MYB轉(zhuǎn)錄因子需要與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合協(xié)同調(diào)控花色素苷的合成[39-40]。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3煙草葉片中NtbHLH基因顯著上調(diào)表達(dá), 說明外源基因StAN1導(dǎo)入煙草后可以激活煙草內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子NtbHLH的表達(dá), 其表達(dá)量在轉(zhuǎn)StAN1-R1煙草中最高, 在轉(zhuǎn)StAN1-R3煙草中最低, 與煙草葉片中花色素苷含量相一致, 因此推測 NtbHLH也是調(diào)控花色素苷合成的重要轉(zhuǎn)錄因子, StAN1與NtbHLH協(xié)同調(diào)控?zé)煵萑~片花色素苷的合成。

綜上所述, StAN1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色素苷合成有兩個(gè)重要機(jī)制, 一是 C末端結(jié)構(gòu)不同的 3個(gè)StAN1同源蛋白調(diào)控花色素苷合成的能力不同, 其中含一個(gè)重復(fù)序列R的StAN1-R1調(diào)控能力最強(qiáng), 說明 R具有重要功能; 二是 StAN1顯著調(diào)控內(nèi)源bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 推測其與bHLH轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控花色素苷生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá), 從而促進(jìn)花色素苷的合成與積累。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆了馬鈴薯R2R3 MYB家族的3個(gè)同源基因StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3。StAN1-R0的分子量最小, StAN1-R3分子量最大。3個(gè)同源基因編碼的蛋白質(zhì)均為不穩(wěn)定狀態(tài), 二級結(jié)構(gòu)均由 α-螺旋、β-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成, 均含有2個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域R2和R3。與StAN1基因同源性最高的為智利番茄和多毛番茄, 同源性最低的為玉米和水稻。葉色深度為StAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3＞CK?；ㄉ剀蘸繛镾tAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3＞CK。StAN1的異源表達(dá)激活了煙草葉片內(nèi)花色素苷合成的早期生物基因(NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtF3’H)和晚期生物基因(NtDFR、NtANS和NtUFGT)的表達(dá), 同時(shí)也顯著增強(qiáng)了內(nèi)源NtbHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 其中, 含有一個(gè)R基序的StAN1-R1調(diào)控能力最強(qiáng)。本研究為更深入了解R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控馬鈴薯塊莖花色素苷合成提供了理論基礎(chǔ)。