管成飛　王君　史同新　王瑩瑩

[摘要]目的探討人類皰疹病毒7型（HHV7）、8型（（HHV8）與扁平苔蘚（LP）之間的相關(guān)性。

方法收集臨床表現(xiàn)典型、經(jīng)病理確診的20例LP病人為實(shí)驗(yàn)組，切取其皮損組織；對(duì)照組為同期行美容外科手術(shù)的健康者17例，切取其皮膚組織。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)兩組皮膚組織的HHV7 DNA和HHV8 DNA的陽(yáng)性情況。

結(jié)果4例LP病人的皮損組織中檢測(cè)出HHV7 DNA，對(duì)照組皮膚組織中未檢測(cè)出HHV7 DNA，兩組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。所有樣本中均未檢測(cè)出HHV8 DNA。

結(jié)論LP皮損組織可以檢測(cè)出HHV7 DNA，但其是否參與了LP的發(fā)病機(jī)制尚不能確定。HHV8可能與LP的發(fā)病沒有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]扁平苔蘚；皰疹病毒7型，人；皰疹病毒8型，人；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號(hào)]R758.65

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02023304

扁平苔蘚（LP）是一種病因不明的炎癥性疾病。其患病率為0.5%～2.0%，常見發(fā)病年齡為31～60歲，男女發(fā)病率基本相等（或者女性稍高）[1]。其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與自身免疫、感染、遺傳、精神神經(jīng)、藥物、代謝和內(nèi)分泌等因素有關(guān)。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，病毒感染可能參與了LP的發(fā)病[213]。本研究探討LP與人類皰疹病毒7型（HHV7）、8型（HHV8）之間的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年5月—2017年7月在我科門診就診、臨床表現(xiàn)典型、經(jīng)病理確診的LP病人20例，其中男9例，女11例；年齡23～62歲，平均（45.8±9.7）歲。選取同期在我院行美容外科手

術(shù)的健康者17例作為對(duì)照組，其中男8例，女9例；年齡25～58歲，平均（43.7±9.8）歲。兩組性別、年齡差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

1.2HHV7 DNA和HHV8 DNA檢測(cè)

1.2.1DNA提取與純化切取LP病人皮損組織和健康對(duì)照者相同部位的皮膚組織，生理鹽水清洗后電子天平稱取10 mg，保存于-80 ℃待測(cè)。應(yīng)用病毒DNA純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）純化提取DNA。DNA提取液保存于-4 ℃待用。

1.2.2引物和探針的設(shè)計(jì)合成根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的HHV7和HHV8基因序列，由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成引物和探針。HHV7 上游引物：5′GTCAAGCTATCCTAATG3′，下

游引物：5′ CTTGCGGTAGCACTAGA3′，探針：5′（FAM）ACrAGAATTCTCC（Eclipse）3′，總長(zhǎng)度為189 bp。HHV8 上游引物：5′ TTTACGGACAGGGATATCAC 3′，下游引物：5′ TGGTCACAAAAGACAGCATC 3′，探針：5′（FAM）CTCCACrAGACA（Eclipse）3′，總長(zhǎng)度為182 bp。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品DNA構(gòu)建利用合成基因的方法制備HHV7、HHV8片段（大連寶生物工程有限公司制作合成），通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建、陽(yáng)性克隆篩選、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒測(cè)序及質(zhì)粒線性化得到HHV7、HHV8標(biāo)準(zhǔn)品DNA。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線建立分別將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品DNA（1013 copies/L）用EASY Dilution按10倍梯度稀釋（0、101、102、103、104、105、106倍）作為模板，應(yīng)用Cycleave PCR對(duì)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。反應(yīng)體系總體積為25.0 μL，內(nèi)含：Cycleave PCR反應(yīng)混合物12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，探針（5 μmol/L）1.0 μL，模板2.0 μL，dH2O 8.5 μL。經(jīng)95 ℃預(yù)變性10 s，再按95 ℃、5 s，55 ℃、10 s，72 ℃、15 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

本文LP皮損組織中檢測(cè)出HHV7 DNA陽(yáng)性4例，陽(yáng)性率為20%；對(duì)照組皮膚組織中未檢測(cè)出HHV7 DNA，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.109）。4例HHV7陽(yáng)性標(biāo)本的DNA拷貝數(shù)分別為0.79×106、2.15×106、2.47×106、3.10 ×106/L。兩組樣本中均未檢測(cè)出HHV8 DNA。

3討論

LP的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)研究認(rèn)為該病是一種自身免疫性疾病。近年來(lái)，病毒感染在LP中的作用受到關(guān)注。病毒感染和LP可能主要通過(guò)免疫因素聯(lián)系起來(lái)，包括T細(xì)胞免疫、體液免疫及抗病毒免疫相關(guān)分子等機(jī)制。

皰疹病毒是一類在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上有重要意義的病毒，它們是典型的雙鏈DNA病毒，在自然界中分布廣泛[14]。HHV7是FRENKEL等[15]于1990年首先從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出的一種嗜淋巴細(xì)胞的皰疹病毒，人群感染率很高，原發(fā)感染多發(fā)生在嬰幼兒期，主要引起嬰幼兒急疹、玫瑰糠疹等疾病。通過(guò)檢測(cè)組織中表達(dá)的HHV7抗原結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，此病毒主要感染CD4+T淋巴細(xì)胞、涎腺細(xì)胞[16]。HHV7主要以潛伏狀態(tài)存在于CD4+T淋巴細(xì)胞中，一旦被激活，可傳播至其他細(xì)胞。在涎腺細(xì)胞中，該病毒通常處于穩(wěn)定的低水平持續(xù)感染狀態(tài)。涎腺細(xì)胞分泌的病毒顆?？梢允箼C(jī)體內(nèi)HHV7長(zhǎng)期存在[17]。HHV8又名Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV），是CHANG等[18]于1994年在AIDS病人Kaposi肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤病毒。HHV8與多種疾病發(fā)病相關(guān)，其中已經(jīng)明確HHV8是Kaposi肉瘤、原發(fā)性滲出型淋巴瘤以及多中心性Castleman病的病原體。HHV8以裂解期和潛伏期兩種形式存在于B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)[19]。

多項(xiàng)研究表明，LP的發(fā)病機(jī)制主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，繼發(fā)和伴隨體液免疫反應(yīng)。皮膚損害的最早病變首先是朗格漢斯細(xì)胞（LC）數(shù)目增多，形態(tài)及功能發(fā)生變化。LP皮損的真皮內(nèi)有CD4+和CD8+兩種T細(xì)胞浸潤(rùn)，而表皮中只有CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。表皮和淋巴細(xì)胞之間反應(yīng)可分為3個(gè)主要時(shí)期：特異性LP抗原識(shí)別、毒性淋巴細(xì)胞活化和角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。LP抗原的性質(zhì)尚不明確，可能是一種自身反應(yīng)的多肽和外源性變性蛋白、化學(xué)物、藥物、金屬、接觸過(guò)敏原、病毒、感染因子和性質(zhì)未明的激發(fā)免疫應(yīng)答的靶抗原。當(dāng)LP抗原作用于角質(zhì)形成細(xì)胞表面時(shí)，LC攝取并處理抗原后提呈給T細(xì)胞，同時(shí)激活LC分泌白細(xì)胞介素1（IL1）等細(xì)胞因子，使T細(xì)胞活化、增殖[20]。T細(xì)胞活化增殖向表皮游走，產(chǎn)生某些細(xì)胞因子和淋巴毒素以及自身的細(xì)胞毒性損傷基底細(xì)胞，從而引起LP的一系列病理變化[21]。

CD4分子屬于免疫球蛋白超家族的成員，是相對(duì)分子質(zhì)量為5.5萬(wàn)～6.0萬(wàn)的單鏈跨膜糖蛋白，其已被確證是HHV7感染靶細(xì)胞的重要受體[22]。HHV7感染CD4+T細(xì)胞后可導(dǎo)致其表面的CD4分子下調(diào)[17]。徐建[23]對(duì)HHV7侵入CD4+T細(xì)胞的分子機(jī)制研究顯示，在HHV7侵入CD4+T細(xì)胞的過(guò)程中，其糖蛋白gB、gH、gL和gO介導(dǎo)了膜融合，且CD4分子參與了膜融合的過(guò)程，由此推測(cè)gB、gH、gL和gO中的某些糖蛋白所組成的復(fù)合物可能是CD4的配體。HHV8導(dǎo)致相關(guān)疾病的確切機(jī)制尚不明確。在特定的免疫缺陷狀態(tài)（如器官移植或感染HIV）時(shí)機(jī)體抗HHV8的免疫反應(yīng)降低，可導(dǎo)致HHV8感染及相關(guān)疾病。HHV8可進(jìn)入樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞等，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并影響其功能[24]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)HHV與皮膚LP的相關(guān)性研究較少。DE VRIES等[25]應(yīng)用PCR檢測(cè)顯示，LP病人皮損樣本、LP病人正常皮膚樣本、銀屑病皮損及健康者皮膚樣本HHV7 DNA感染率分別為11/18、1/11、2/11、0/4，推測(cè)HHV7在LP皮損中繁殖，HHV7可能參與了LP的發(fā)病機(jī)制，并且在表皮和真皮的交界處周圍檢測(cè)到HHV7的pp85抗原，這與LP病灶的帶狀炎性浸潤(rùn)部位相一致。DE VRIES等[26]的另一項(xiàng)研究顯示，LP病人治療前和皮損緩解后HHV7 DNA陽(yáng)性率分別為61%（11/18）和8%（1/13），且表皮和真皮中攜帶HHV7的細(xì)胞數(shù)量在緩解后顯著降低，進(jìn)一步支持HHV7參與LP發(fā)病機(jī)制。NAHIDI等[27]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HHV7可能參與了LP的發(fā)病機(jī)制。徐陽(yáng)春[28]采用巢式PCR法檢測(cè)顯示，LP皮損組織HHV7 DNA陽(yáng)性率為88.2%（30/34），與健康人皮膚組織及臨床表現(xiàn)疑似LP而病理診斷非LP的病變皮膚組織HHV7 DNA陽(yáng)性率比較，差異均有顯著性。劉芳[29]研究顯示，LP病人血清HHV6 DNA陽(yáng)性率為5.6%（5/90），對(duì)照組為0，兩組比較差異有顯著性；HHV7 DNA陽(yáng)性率為10%（9/90），對(duì)照組未檢出，差異有顯著性。

本文研究結(jié)果顯示，LP組皮損組織中HHV7 DNA陽(yáng)性率為20%，且陽(yáng)性標(biāo)本DNA拷貝數(shù)偏低，對(duì)照組未檢測(cè)出HHV7 DNA，兩組比較差異無(wú)顯著性。推測(cè)可能的原因：①樣本例數(shù)偏少， LP皮損組織和健康者皮膚組織HHV7 DNA差異性沒有得到充分反映；②HHV7在人群中感染率較高，超過(guò)95%的成人HHV7血清學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性[30]，本文4例HHV7 DNA陽(yáng)性標(biāo)本的DNA拷貝數(shù)偏低，不排除為隨機(jī)感染HHV7。HHV7是否參與了LP的發(fā)病機(jī)制尚不能確定。本文所有LP病人皮損組織中均未檢測(cè)出HHV8 DNA，推測(cè)HHV8可能與LP的發(fā)病沒有相關(guān)性。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）