趙坤　侯勃　王茂敬　趙青　李培慧　蔡尚郎

[摘要]目的研究血管內(nèi)皮球囊損傷后銅伴侶蛋白1（Atox1）、賴氨酸氧化酶（Lox）的表達(dá)及纈沙坦對其影響，探討Atox1、Lox及纈沙坦在血管再狹窄中的作用。

方法Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為對照組、手術(shù)組和藥物組，各12只。制備大鼠主動脈球囊損傷后再狹窄動物模型，藥物組給予纈沙坦灌胃，對照組、手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，各組分別于術(shù)后14、28 d取6只大鼠腹主動脈，檢測主動脈內(nèi)膜、中膜厚度，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)。

結(jié)果與對照組比較，手術(shù)組術(shù)后14、28 d主動脈內(nèi)膜、中膜增厚，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)明顯上升；與手術(shù)組比較，藥物組術(shù)后14、28 d主動脈內(nèi)膜、中膜增生減輕，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)下降，差異有顯著性（F=25.73～34.16，P<0.05）。

結(jié)論Atox1、Lox參與大鼠主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生過程；纈沙坦可抑制內(nèi)膜增生，其作用與下調(diào)Atox1、Lox的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮，血管；銅伴侶蛋白1；賴氨酸氧化酶；纈沙坦

[中圖分類號]R361.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02022504

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CHD）是目前常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率逐年增加，病死率較高，已經(jīng)成為威脅人類健康的首位疾病[1]。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）已成為CHD治療的重要手段，但PCI術(shù)后再狹窄卻是一個尚未解決的難題，其半年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率高達(dá)40%。藥物洗脫支架的誕生雖明顯降低再狹窄率，但仍可達(dá)6.4%[23]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）遷移和增殖是PCI術(shù)后再狹窄的主要機(jī)制[4]，而血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）參與了此過程。AngⅡ主要通過血管緊張素1（AT1）型受體引起新生內(nèi)膜形成[5]。銅是維持人體正常生理功能的一種必不可少微量元素，其在創(chuàng)傷修復(fù)、血管再生等生理修復(fù)過程和腫瘤生長、神經(jīng)變性疾病、動脈粥樣硬化等病理生理過程中起重要作用[68]。研究證實銅水平影響動脈粥樣硬化的形成[9]，在血管損傷時增加銅的水平可加劇動脈狹窄[10]。銅伴侶蛋白1（Atox1）是一種銅伴侶蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞、抵抗氧化的功能，并在細(xì)胞內(nèi)對銅轉(zhuǎn)移、儲存、

分布起重要作用[11]。研究表明，Atox1表達(dá)增加可引起VSMC的增殖和遷移[12]。賴氨酸氧化酶（Lox）是一種銅依賴性氨基氧化酶，能夠參與細(xì)胞外膠原和彈性纖維的賴氨酸殘基交聯(lián)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，并在VSMC遷移、細(xì)胞外基質(zhì)聚集等過程中發(fā)揮重要作用。已有研究顯示，Atox1和Lox參與球囊損傷術(shù)后再狹窄的過程[1314]，參與了AngⅡ引起的血管增生、重塑及細(xì)胞外基質(zhì)聚集等[1516]。纈沙坦是一種AngⅡ受體拮抗劑（ARB），其能夠抑制血管損傷后再狹窄的形成[1718]，但在血管損傷中使用纈沙坦對Atox1和Lox表達(dá)影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本文對Atox1、Lox及纈沙坦在血管再狹窄中的作用進(jìn)行探討。

1材料和方法

1.1動物分組及處理

選取雄性Wistar大鼠36只（購自青島市動物中心），體質(zhì)量300～350 g，隨機(jī)分為對照組、手術(shù)組和藥物組，各12只。手術(shù)組：用0.6 mol/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，沿頸前正中線切開皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、頸外動脈，自頸外動脈送入自制球囊至腹主動脈，并且注入生理鹽水0.15～0.20 mL使球囊充分膨脹，慢速回拉球囊至主動脈弓，反復(fù)3次；退出球囊，結(jié)扎頸外動脈，逐層縫合。術(shù)后常規(guī)用青霉素40萬單位預(yù)防感染，常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)前1 d至實驗終點前給予生理鹽水3 mL灌胃。藥物組：手術(shù)操作同手術(shù)組，術(shù)前1 d至實驗終點給予纈沙坦（北京諾華制藥有限公司）20 mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水3 mL灌胃。對照組：將球囊送至腹主動脈緩慢回拉球囊至主動脈弓，反復(fù)3次，不擴(kuò)張球囊，其余操作同手術(shù)組，術(shù)前1 d至實驗終點給予生理鹽水3 mL灌胃。

1.2標(biāo)本制備及組織學(xué)檢查

選擇術(shù)后14、28 d為實驗終點，在相應(yīng)終點3組各處死6只大鼠，剪取腹主動脈近主動脈弓端5 mm動脈血管，置于40 g/L甲醛中固定，制作石蠟包塊，行常規(guī)蘇木精伊紅（HE）染色和免疫組化檢查。其余血管段-80 ℃凍存。HE染色后光鏡下觀察VSMC移行、增殖及內(nèi)膜增厚情況并拍照。

1.3實時熒光定量PCR檢測血管組織中Atox1及Lox mRNA的表達(dá)

分別取各組血管標(biāo)本，充分剪碎研磨后加入Trizol試劑（美國，Invitrogen公司）1 mL裂解，在無RNA酶的環(huán)境中，Trizol法提取總RNA，紫外線分光光度計測定RNA純度，A260/A280為1.7～2.0，提示RNA純度較高。應(yīng)用實時定量RTPCR試劑盒檢測血管組織中Atox1、Lox mRNA表達(dá)水平。PCR引物及其序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（42 ℃、60 min，70 ℃、10 min），-20 ℃儲存。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40次。檢測得到循環(huán)閾值（Ct值），以βactin作為內(nèi)參校準(zhǔn)基因，用相對定量方法計算2-△△Ct，以其表示基因相對表達(dá)量。

1.4免疫組化檢測Atox1蛋白表達(dá)

將腹主動脈蠟塊切片，采用鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物法進(jìn)行Atox1免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒（美國Santan Gruz公司）說明書進(jìn)行操作。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為對照。光學(xué)顯微鏡下觀察，Atox1表達(dá)于平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿，陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核、細(xì)胞漿棕色。應(yīng)用Imageproplus Software 5.0圖像分析軟件，以累計光密度值表示該蛋白的相對表達(dá)量。

1.5酶聯(lián)免疫法檢測Lox蛋白表達(dá)

取凍存的血管片段35 mg，研磨、勻漿，3000 r/min離心20 min后提取上清液，酶聯(lián)免疫法檢測Lox水平，按試劑盒（武漢中美科技有限公司）說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測定結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料結(jié)果用[AKx-D]±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較用LSDt檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠主動脈組織學(xué)比較

手術(shù)組14 d內(nèi)膜、中膜明顯增生，以內(nèi)膜為主，其中可見大量VSMC增殖，排列紊亂，內(nèi)彈力層較為迂曲；28 d增生更加明顯，其細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，但VSMC增殖已明顯減少。藥物組14 d和

28 d內(nèi)膜增生較手術(shù)組明顯減輕，增生及移行至內(nèi)膜的VSMC數(shù)量降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著減少。與對照組比較，手術(shù)組術(shù)后14、28 d主動脈內(nèi)膜、中膜厚度增加；與手術(shù)組比較，藥物組主動脈內(nèi)膜、中膜厚度降低，差異有顯著性（F=25.79～28.76，P<0.05）。見表1。

2.2各組Atox1、Lox mRNA表達(dá)水平比較

術(shù)后14、28 d，手術(shù)組Atox1、Lox mRNA表達(dá)較對照組明顯增高，藥物組Atox1、Lox mRNA表達(dá)較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=27.13～34.16，P<0.05）。見表2。

2.3各組Atox1、Lox蛋白表達(dá)比較

術(shù)后14、28 d，手術(shù)組Atox1、Lox蛋白表達(dá)較對照組明顯增高，藥物組Atox1、Lox蛋白表達(dá)較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=25.73～30.51，P<0.05）。見表2。

3討論

在CHD的治療史中，PCI的出現(xiàn)可謂里程碑事件，為CHD的治療帶來革命性的變化，但PCI術(shù)后再狹窄卻是一個尚未解決的難題。如本文實驗所見，血管球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜及中膜明顯增生。再狹窄機(jī)制復(fù)雜，包括內(nèi)皮損傷、血栓形成、VSMC增殖遷移、細(xì)胞外基質(zhì)聚集及炎癥因子的激活等，其中VSMC遷移和增殖是PCI術(shù)后再狹窄的主要機(jī)制[3，1921]。VSMC在生理狀態(tài)下位于血管中膜，處于細(xì)胞周期的靜止期，主要通過收縮和舒張調(diào)節(jié)血管張力。當(dāng)血管損傷后，VSMC轉(zhuǎn)變表型進(jìn)入分裂周期，其從中膜遷移至內(nèi)膜，在內(nèi)膜分裂增殖，并合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)形成新生內(nèi)膜[22]。

AngⅡ是腎素血管緊張素系統(tǒng)中主要活性肽，其作用廣泛，當(dāng)血管受損時，AngⅡ表達(dá)明顯增加，其可通過AT1引起VSMC的增殖和遷移，促進(jìn)血管內(nèi)膜增生，引起血管再狹窄[2325]。銅是維持機(jī)體正常生理功能不可或缺的微量元素之一，銅與心血管疾病關(guān)系的研究由來已久[26]。Atox1是一種重要的銅伴侶蛋白，其內(nèi)含有一個獨特的序列——MXCXXC（其中M為甲硫氨酸，X為任意氨基酸，C代表半胱氨酸），能高效緊密地結(jié)合銅并將其轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)。Atox1與銅水平可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[27]，且能夠影響銅的分布。研究表明，Atox1參與平滑肌細(xì)胞的增殖[12]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Atox1參與平滑肌細(xì)胞的遷移和血管損傷后的重塑[14]。本文研究結(jié)果顯示，血管球囊損傷術(shù)后Atox1表達(dá)增加，提示其可能參與血管損傷術(shù)后再狹窄的過程。Lox是銅依賴的賴氨酸氧化酶，只有結(jié)合銅的Lox才具有較高的活性，其主要參與催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和纖維蛋白的賴氨酸殘基交聯(lián)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[28]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，降低Lox轉(zhuǎn)錄可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)活性，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加[2930]。Lox在VSMC增殖方面的作用仍有爭議，但其影響VSMC遷移已被肯定。本文研究結(jié)果顯示，血管球囊損傷后Lox的表達(dá)增加，提示其可能與血管球囊損傷術(shù)后再狹窄有關(guān)。纈沙坦是高選擇性ARB，能競爭性抑制AngⅡ的作用，抑制VSMC增殖、遷移，減少內(nèi)膜損傷后重塑。本文研究結(jié)果顯示，纈沙坦可減輕損傷后血管內(nèi)膜的增生，并且應(yīng)用纈沙坦后Atox1、Lox mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低，提示纈沙坦抑制血管內(nèi)膜增生可能與Atox1、Lox的表達(dá)變化有關(guān)。但本實驗只是顯示了血管損傷術(shù)后Atox1、Lox表達(dá)增加的現(xiàn)象，卻沒有進(jìn)一步闡明其具體機(jī)制。需要進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究，以明確PCI術(shù)后再狹窄的機(jī)制及纈沙坦對其作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]唐勝惠，楊朝品. 冠狀動脈介入治療冠心病的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)學(xué)工程， 2017，25（6）：3538.

[2]AUFFRET V， BERLAND J， BARRAGAN P， et al. Treatment of drugeluting stents instent restenosis with paclitaxelcoated balloon angioplasty： insights from the French “real

world” prospective GARO registry[J]. Int J Cardiol， 2016，203：690696.

[3]呂小棉，陳亞麗. 對抗經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后冠狀動脈再狹窄的研究進(jìn)展[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展， 2015，36（6）：708712.

[4]GARERI C， DE ROSA S， INDOLFI C. MicroRNAs for res

tenosis and thrombosis after vascular injury[J]. Circ Res， 2016，118（7）：11701184.

[5]KAWAI T， FORRESTER S J， OBRIEN S， et al. AT1 receptor signaling pathways in the cardiovascular system[J]. Pharmacol Res， 2017，125（Pt A）：413.

[6]NISHITO Y， KAMBE T. Absorption mechanisms of Iron， Copper， and Zinc： an overview[J]. J Nutr Sci Vitaminol （Tokyo）， 2018，64（1）：17.

[7]DENOYER D， SAS C， CATER M A. Copper complexes in cancer therapy[J]. Met Ions Life Sci， 2018，18. doi：10.1515/9783110470734022.

[8]KAWAHARA M， TANAKA KI， KATONEGISHI M. Zinc， carnosine， and neurodegenerative diseases[J]. Nutrients， 2018，10（2）.doi：10.3390/nu10020147.

[9]STADLER N， LINDNER R A， DAVIES M J. Direct detection and quantification of transition metal ions in human atherosclerotic plaques： evidence for the presence of elevated levels of iron and copper[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2004，24（5）：949954.

[10]NUNES K Z， FIORESI M， MARQUES V B， et al. Acute copper overload induces vascular dysfunction in aortic rings due to endothelial oxidative stress and increased nitric oxide production[J]. J Toxicol Environ Health A， 2018，81（8）：218228.

[11]DATZ C， MULLER E， AIGNER E. Iron overload and nonalcoholic fatty liver disease[J]. Minerva Endocrinol， 2017，42（2）：173183.

[12]ITOH S， KIM H W， NAKAGAWA O， et al. Novel role of antioxidant1 （Atox1） as a copperdependent transcription factor involved in cell proliferation[J]. J Biol Chem， 2008，283（14）：91579167.

[13]NUTHAKKI V K， FLESER P S， MALINZAK L E， et al. Lysyl oxidase expression in a rat model of arterial balloon injury[J]. J Vasc Surg， 2004，40（1）：123129.

[14]KOHNO T， URAO N， ASHINO T， et al. Novel role of copper transport protein antioxidant1 in neointimal formation after vascular injury[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2013，33（4）：805813.

[15]EBERSON L S， SANCHEZ P A， MAJEED B A， et al. Effect of lysyl oxidase inhibition on angiotensin Ⅱinduced arterial hypertension， remodeling， and stiffness[J]. PLoS One， 2015，10（4）：e0124013.

[16]OZUMI K， SUDHAHAR V， KIM H W， et al. Role of copper transport protein antioxidant 1 in angiotensin Ⅱinduced hypertension： a key regulator of extracellular superoxide dismutase[J]. Hypertension， 2012，60（2）：476486.

[17]苘瑜琳，李永紅，劉平，等. 纈沙坦對大鼠主動脈內(nèi)皮球囊損傷后血管緊張素轉(zhuǎn)化酶與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ表達(dá)的影響[J]. 中國動脈硬化雜志， 2010，18（2）：109113.

[18]EGUCHI S， KAWAI T， SCALIA R， et al. Understanding angiotensin Ⅱ type 1 receptor signaling in vascular pathophysio

logy[J]. Hypertension， 2018. doi：10.1161/ HYPERTENSIONAHA.118.10266.

[19]SMILJIC S. The clinical significance of endocardial endothelial dysfunction[J]. Medicina （Kaunas）， 2017，53（5）：295302.

[20]RAHIMI N. Defenders and challengers of endothelial barrier function[J]. Front Immunol， 2017，8：18471857.

[21]MONTECUCCO F， LIBERALE L， BONAVENTURA A， et al. The role of inflammation in cardiovascular outcome[J]. Curr Atheroscler Rep， 2017，19（3）：1121.

[22]FARIES P L， ROHAN D I， WYERS M C， et al. Vascular smooth muscle cells derived from atherosclerotic human arte

ries exhibit greater adhesion， migration， and proliferation than venous cells[J]. J Surg Res， 2002，104（1）：2228.

[23]SZCZEPANSKASADOWSKA E， CZARZASTA K， CUDNOCHJEDRZEJEWSKA A. Dysregulation of the reninangiotensin system and the vasopressinergic system interactions in cardiovascular disorders[J]. Curr Hypertens Rep， 2018，20（3）：1931.

[24]LI J， WANG S， BAI J， et al. Novel role for the immunoproteasome subunit PSMB10 in angiotensin Ⅱinduced atrial fibrillation in mice[J]. Hypertension， 2018.doi：10.1161/ HYPERTENSIONAHA.117.10390.

[25]BRUDERNASCIMENTO T， CHINNASAMY P， RIASCOSBERNAL D F， et al. Angiotensin Ⅱ induces Fat1 expression/activation and vascular smooth muscle cell migration via Nox1dependent reactive oxygen species generation[J]. J Mol Cell Cardiol， 2014，66：1826.

[26]BOST M， HOUDART S， OBERLI M， et al. Dietary copper and human health： current evidence and unresolved issues[J]. J Trace Elem Med Biol， 2016，35：107115.

[27]SHIN L J， LO J C， YEH K C. Copper chaperone antioxidant protein1 is essential for copper homeostasis[J]. Plant Physiol， 2012，159（3）：10991110.

[28]LEIVA O， LEON C， KAH N S， et al. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function[J]. Am J Hematol， 2018，93（3）：430441.

[29]JOVER E， SILVENTE A， MARIN F， et al. Inhibition of enzymes involved in collagen crosslinking reduces vascular smooth muscle cell calcification[J]. FASEB J， 2018：fj201700653R. doi：10.1096/fj.201700653R.

[30]GRINER J D， ROGERS C J， ZHU M J， et al. Lysyl oxidase propeptide promotes adipogenesis through inhibition of FGF2 signaling[J]. Adipocyte， 2017，6（1）：1219.

（本文編輯黃建鄉(xiāng)）