劉建亞 馮文靜 牟婕 安妮娜 王仁萍 毛擁軍

[摘要]目的探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）對D半乳糖（Dgal）誘導(dǎo)的衰老小鼠的心臟保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

方法將24只8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和干細(xì)胞組，每組8只。對照組頸背部皮下注射滅菌注射用水（5 mL·kg-1·d-1）8周，模型組和干細(xì)胞組頸背部皮下注射Dgal（150 mg·kg-1·d-1）8周，至Dgal注射第5周和第7周時(shí)，干細(xì)胞組分別尾靜脈注射1×106個(gè)hUCMSCs，對照組和模型組尾靜脈注射1×PBS（每只0.2 mL）。采用蘇木精伊紅染色觀察心肌組織病理改變，Western Blot檢測熱休克蛋白70（HSP70）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達(dá)水平，RTPCR檢測炎癥小體相關(guān)基因NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、白細(xì)胞介素18（IL18）、白細(xì)胞介素1β（IL1β）mRNA的表達(dá)。

結(jié)果病理學(xué)檢查顯示，模型組出現(xiàn)心肌組織退行性改變，而對照組和干細(xì)胞組無相應(yīng)改變。模型組心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達(dá)較對照組顯著下降，干細(xì)胞組HSP70和VEGF蛋白表達(dá)較模型組顯著升高（F=9.76、43.87，P<0.05）。模型組心肌組織中炎癥小體相關(guān)基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表達(dá)較對照組顯著增加，干細(xì)胞組心肌組織中炎癥小體相關(guān)基因表達(dá)較模型組顯著下降（F=30.04～44.45，P<0.05）。

結(jié)論hUCMSCs能有效緩解Dgal誘導(dǎo)的心臟老化，其機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生和抑制NLRP3炎癥小體通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞;臍帶;心臟;衰老;NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3;半乳糖

[中圖分類號]R329.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02018905

衰老是一種正常的生理現(xiàn)象，隨著年齡增長，機(jī)體出現(xiàn)一系列退行性改變，從而引起一系列疾病，如心血管疾病。在機(jī)體衰老的過程中，固有免疫應(yīng)答被激活，從而產(chǎn)生一種系統(tǒng)性、低水平的慢性炎癥，即炎性衰老[1]。炎癥小體是由多種蛋白組成的復(fù)合體，在機(jī)體固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，其中NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體目前研究最為廣泛，它可以促進(jìn)白細(xì)胞介素18（IL18）和白細(xì)胞介素1β（IL1β）等炎癥因子的成熟和釋放，從而引起一系列炎癥反應(yīng)[23]。研究表明，當(dāng)機(jī)體促炎癥遞質(zhì)腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL6）、IL18、IL1β等水平升高時(shí)，機(jī)體處于一種促炎癥狀態(tài)，引起炎性衰老的發(fā)生[4]。熱休克蛋白70（HSP70）具有抗炎作用，隨著年齡的增長其表達(dá)下調(diào)，在機(jī)體衰老過程中起著重要的作用，現(xiàn)已作為衰老的生物學(xué)標(biāo)志物之一[56]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，可以延緩大鼠自然衰老引起的心臟老化，改善衰老引起的心功能下降[7]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）可以直接從人臍帶華爾通膠中獲得，具有易于獲取和分離、來源豐富、不涉及倫理問題、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床研究[8]。hUCMSCs是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，在一定環(huán)境下可以分化成機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞，具有促進(jìn)組織修復(fù)與再生、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）分泌等生物學(xué)作用[910]，有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。D半乳糖（Dgal）可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，進(jìn)而加速機(jī)體衰老的進(jìn)程，尤其是腦、心臟等組織器官的衰老;Dgal致衰老模型具有價(jià)格低廉、簡單易行、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于老年病、衰老機(jī)制、抗衰老藥物篩選等方面的研究[1113]。本研究采用Dgal誘導(dǎo)的心臟老化動(dòng)物模型，探討hUCMSCs對衰老小鼠的心臟保護(hù)作用及其可能機(jī)制，以期為延緩心臟老化提供新的理論依據(jù)及干預(yù)靶點(diǎn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物SPF級C57BL/6雄性小鼠24只，8周齡，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。小鼠在12 h晝夜循環(huán)、室溫18～22 ℃、相對濕度40%～60%的條件下，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2細(xì)胞和試劑hUCMSCs由國家干細(xì)胞與生物診療工程研究中心青島奧克生物開發(fā)有限公司提供;Dgal購自美國Sigma公司，VEGF鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，HSP70兔單克隆抗體購自Abcam公司，GADPH兔抗多克隆抗體、山羊抗鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體購自武漢伊萊瑞特公司，RIPA裂解液購自上海碧云天公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL顯影液購自美國Millipore公司，TRIzol購自美國Life Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Mix購自瑞士Roche公司。

1.1.3主要儀器實(shí)驗(yàn)用凝膠成像分析儀購自法國VILBER公司，Western Blot蛋白檢測儀購自美國BioRad公司，RTPCR儀購自瑞士Roche公司，熱循環(huán)儀購自美國Perkin Elmer公司，紫外線分光光度計(jì)購自德國IMPLEN公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理24只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和干細(xì)胞組，每組8只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對照組給予頸背部皮下注射滅菌注射用水5 mL·kg-1·d-1，模型組和干細(xì)胞組給予頸背部皮下注射Dgal 150 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射8周。至Dgal注射第5周和第7周，干細(xì)胞組尾靜脈注射1×106 個(gè)hUCMSCs，對照組和模型組尾靜脈注射1×PBS（每只0.2 mL）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱體質(zhì)量、處死動(dòng)物，留取心臟組織標(biāo)本。取小鼠心肌組織，用甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2Western Blot檢測HSP70和VEGF蛋白表達(dá)用RIPA裂解液裂解心臟組織，BCA法測定蛋白質(zhì)含量，取等量的蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上

（200 mA、110 min），以含30 g/L BSA和50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加一抗4 ℃搖床孵育過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL顯影，用凝膠成像分析儀捕捉圖像，Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.2.3RTPCR方法檢測NLRP3、IL18以及IL1β的mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取各組心臟組織的總RNA，紫外線分光光度法測定并計(jì)算提取的總RNA含量及濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用RTPCR法檢測炎癥小體相關(guān)基因NLRP3、IL18和IL1β mRNA相對表達(dá)量。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。RTPCR反應(yīng)條件：95 ℃、600 s;95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共45個(gè)循環(huán);95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，97 ℃、1 s。以βactin作為參照，根據(jù)2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1小鼠一般情況

對照組和干細(xì)胞組小鼠精神狀態(tài)好，行動(dòng)敏捷，毛發(fā)有光澤，皮膚彈性好;模型組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，自主活動(dòng)減少，行動(dòng)遲緩，身體略弓起，毛發(fā)枯黃且易脫落，皮膚彈性差，精神萎靡。

2.2小鼠心肌組織病理學(xué)變化

對照組心肌結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、大小正常;模型組心肌細(xì)胞排列紊亂、間隙增大，細(xì)胞變大，表現(xiàn)出老化的特征;與模型組比較，干細(xì)胞組心肌細(xì)胞大小正常、排列規(guī)整、間隙變小。

2.3各組小鼠心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達(dá)比較

模型組小鼠心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達(dá)較對照組下降，干細(xì)胞組HSP70和VEGF蛋白表達(dá)較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.76、43.87，P<0.05）。見圖1。

2.4各組小鼠心肌組織NLRP3、IL18和IL1β mRNA表達(dá)比較

模型組小鼠心肌組織中的炎癥小體相關(guān)基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表達(dá)較對照組升高，干細(xì)胞組心肌組織中炎癥小體相關(guān)基因表達(dá)較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.04～44.45，P<0.05）。見圖2。

3討論

隨著年齡的增長，衰老相關(guān)性疾病發(fā)病率增長迅速，因此延緩衰老的速度，甚至逆轉(zhuǎn)衰老成為目前研究的熱點(diǎn)。近年來，Dgal誘導(dǎo)的衰老模型被國內(nèi)外的學(xué)者廣泛應(yīng)用，如神經(jīng)退行性變模型、心臟老化模型、生殖功能退化模型等[11，14]。在正常情況下，機(jī)體可以將Dgal代謝為葡萄糖，然而在過量的情況下，Dgal誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過量的氧自由基和糖基化終末產(chǎn)物，后者作用于糖基化終末產(chǎn)物受體，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)劑，激活小鼠體內(nèi)炎癥小體通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，加速衰老，表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量增長緩慢、自主活動(dòng)減少、毛發(fā)枯黃、精神萎靡等衰老的特征，另外，心肌組織出現(xiàn)心肌細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞肥大等損傷的病理學(xué)表現(xiàn)。尾靜脈注射hUCMSCs后，Dgal誘導(dǎo)的機(jī)體衰老特征得到改善，心臟組織損傷得到恢復(fù)。

HSP70作為衰老的標(biāo)志物之一，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。HSP70可能是通過抑制IκBα磷酸化，從而抑制NFκB激活下游的TNFα、IL1β、IL6等促炎癥因子的釋放，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5，17]。HSP70還可通過調(diào)節(jié)全身炎癥狀態(tài)，保護(hù)機(jī)體臟器不受增齡相關(guān)的慢性炎癥損傷[18]。VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可促進(jìn)新生血管生成，改善心肌梗死后心臟功能[1920]。hUCMSCs可促進(jìn)VEGF的分泌，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)血管新生，抑制細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生[9]。本文研究結(jié)果顯示，靜脈注射hUCMSCs能夠上調(diào)Dgal誘導(dǎo)的老化心肌組織中HSP70、VEGF蛋白的表達(dá)，具有抑制心臟慢性炎癥進(jìn)展、促進(jìn)心臟血管新生，進(jìn)而延緩心臟老化的作用。

NLRP3炎癥小體在許多慢性疾病中扮演著重要角色，能夠引起慢性、系統(tǒng)性炎癥以及慢性器官衰竭[21]。有研究表明，Dgal誘導(dǎo)的衰老模型可激活炎癥小體通路，引起機(jī)體IL18、IL1β等促炎癥因子的釋放，從而加速炎性衰老的進(jìn)程，該通路在年齡相關(guān)的心血管疾病中亦起著重要的作用[2，22]。研究也表明，移植間充質(zhì)干細(xì)胞可以延緩大鼠自然老化導(dǎo)致的心功能下降[7]，抑制脂多糖活化的NLRP3炎癥小體活性，從而抑制因炎癥反應(yīng)引起的損傷[23]。hUCMSCs在適當(dāng)?shù)臈l件下可以分化為心肌細(xì)胞，參與心臟損傷的組織修復(fù)[24]，還可通過旁分泌機(jī)制分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)受損心臟組織的自我修復(fù)[25]。本文研究結(jié)果顯示，將hUCMSCs通過尾靜脈注射到Dgal誘導(dǎo)的衰老小鼠體內(nèi)，不僅小鼠的衰老特征得到改善，心肌組織中NLRP3炎癥小體通路也得到抑制，促炎癥因子IL18和IL1β mRNA表達(dá)下降，說明hUCMSCs可以改善Dgal誘導(dǎo)的心臟老化，抑制炎性衰老的進(jìn)展。

綜上所述，hUSMSCs可以延緩Dgal誘導(dǎo)的小鼠心臟老化進(jìn)展，該作用可能是通過促進(jìn)血管新生、抑制炎癥小體通路激活實(shí)現(xiàn)的，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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