薛寶　常曉麗　賈璐　石麗敏　謝俊霞

[摘要]目的

探討ghrelin是否通過抑制A型鉀通道電流增強(qiáng)正常小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電。

方法[HTSS]應(yīng)用出生15～20 d的C57BL/6小鼠制備腦片，腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察ghrelin對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率及A型鉀通道電流幅度的影響。

結(jié)果[HTSS]小鼠黑質(zhì)腦片灌流100 nmol/L ghrelin，多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯升高（n=5，t=3.55，P<0.05）；應(yīng)用A型鉀通道阻斷劑4AP可以完全阻斷ghrelin的細(xì)胞興奮效應(yīng)。應(yīng)用100 nmol/L ghrelin可以明顯抑制A型鉀電流的電流幅度（n=5，t=5.67，P<0.01）。

結(jié)論[HTSS]Ghrelin能夠提高正常小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，其機(jī)制可能是通過抑制A型鉀通道電流實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]胃促生長(zhǎng)素；黑質(zhì)；多巴胺能神經(jīng)元；A型鉀通道

[中圖分類號(hào)]R338.8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02012704

Ghrelin是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種生物活性肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（GHSR）的唯一內(nèi)源性配體[12]，通過影響神經(jīng)元的電活動(dòng)，在攝食、能量代謝平衡、生長(zhǎng)激素釋放及學(xué)習(xí)記憶等多方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin對(duì)帕金森?。≒D）黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用[34]，提示其在PD治療中具有潛在應(yīng)用前景。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，ghrelin可以促進(jìn)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元電活動(dòng)[5]。由于黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的電活動(dòng)變化直接影響紋狀體區(qū)DA的釋放，在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)以及PD中發(fā)揮著重要的作用[6]，因此，闡明ghrelin調(diào)控黑質(zhì)DA能神經(jīng)元電活動(dòng)的機(jī)制具有重要的意義。A型鉀通道電流（IA）是一種快速激活、快速失活的鉀電流[78]，在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元上有較高表達(dá)，是影響DA能神經(jīng)元自發(fā)放電的關(guān)鍵因素，對(duì)動(dòng)作電位的幅度、時(shí)程和放電頻率發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3，911]。以往有研究指出，ghrelin可以顯著降低體外培養(yǎng)的GH3細(xì)胞系中IA的電流幅度[5，12]。

然而，ghrelin是否對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的IA有影響并由此改變神經(jīng)元的興奮性目前尚不清楚。本研究旨在探討ghrelin對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元中IA的影響及對(duì)神經(jīng)元自身興奮效應(yīng)的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生后15～20 d的C57BL/6小鼠，由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑Ghrelin為美國Tocris公司提供，開封前需在離心機(jī)上離心，然后用無菌注射器注入無菌水，稀釋為10-4 mol/L，-20 ℃保存，用前稀釋至10-7 mol/L。河鲀毒素（TTX）由美國Tocris公司提供，用人工腦脊液（ACSF）稀釋成1.0 mmol/L的母液，終濃度為0.5 nmol/L。氯化鎘 （CdCl2）、4氨基吡啶 （4AP） 為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3溶液配制①ACSF的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、1.3 mmol/L NaH2PO4、

26.0 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L CaCl2、2.4 mmol/

L MgCl2、10.0 mmol/L Glucose混合，調(diào)整pH值7.4 （1 mol/L NaOH稀釋），

滲透壓770 kPa（用滲透

壓測(cè)量?jī)x測(cè)量），并持續(xù)通入含體積分?jǐn)?shù)

0.05 CO2及體積分?jǐn)?shù)0.95 O2的混合氣進(jìn)行氧合。②低鈣切片液配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、1.3 mmol/L NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、2.0 mmol/L CaCl2、

1.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/

L Glucose混合，使用1 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，滲透壓為770 kPa（用滲透壓測(cè)量?jī)x檢測(cè)），并持續(xù)通含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2及體積分?jǐn)?shù)0.95的O2的混合氣進(jìn)行氧合。③電極內(nèi)液的配制：120.0 mmol/L Kgluconate、20.0 mmol/L KCl、

10.0 mmol/L HEPES、10.0 mmol/L EGTA、2.0 mmol/L MgCl2、

2.0 mmol/L Na2ATP以及0.3 mmol/L的Na2GTP混合，

用1 mol/L KOH 調(diào)節(jié) pH 值為7.3，500 μL分裝后-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1離體黑質(zhì)腦片制備小鼠迅速斷頭取腦，并置于4 ℃下ACSF中，1 min后將修剪好的腦切成250 μm厚的腦切片，放入連續(xù)通入體積分?jǐn)?shù)0.95 O2及體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2混合氣體的ACSF中，孵育1 h，然后將腦片室溫下放置。隨機(jī)取其中一片腦片進(jìn)行腦片全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，其余的腦片培養(yǎng)在 ACSF 中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2腦片全細(xì)胞膜片鉗電生理學(xué)記錄將離體腦片轉(zhuǎn)移至持續(xù)灌流ACSF（持續(xù)通入有體積分?jǐn)?shù)0.95 O2及體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2混合氣體）的浴槽內(nèi)，選擇健康、飽滿、邊界清晰的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。將拋光的玻璃微電極（電阻為5～10 MΩ）注入合適體積的電極內(nèi)液，直至電極尖端進(jìn)入液面以下，當(dāng)電極尖端慢慢接近細(xì)胞表面直至在細(xì)胞表面壓出類似“酒窩”的形狀，此時(shí)電流變小，電阻慢慢變大。迅速釋放正壓，快速達(dá)到千兆封接（GΩ）。如果電阻沒有達(dá)到千兆，則通過注射器給予細(xì)胞膜片一個(gè)負(fù)壓，使之達(dá)到千兆封接，并補(bǔ)償快電容。之后，采用負(fù)壓法吸破電極與細(xì)胞相接觸的膜片，使電極與細(xì)胞內(nèi)液相通，并補(bǔ)償慢電容。轉(zhuǎn)換至電流鉗模式，將電流鉗置在0 pA，完成全細(xì)胞電流鉗記錄模式，判斷為黑質(zhì)DA能神經(jīng)元后，轉(zhuǎn)換至全細(xì)胞電壓鉗模式，將電壓鉗置在-70 mV，完成全細(xì)胞電壓鉗模式電流記錄。數(shù)據(jù)用Patchmaster軟件采樣并儲(chǔ)存，用Minianalysis、Clamfit等軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用[AKx-D]±s表示。同一個(gè)神經(jīng)元加不同藥物自發(fā)放電頻率比較采用方差分析；同一個(gè)神經(jīng)元加藥前后IA幅度變化比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1Ghrelin對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的影響

本文實(shí)驗(yàn)記錄了5個(gè)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，自發(fā)放電頻率為（1.84±0.24）Hz，灌流含有100 nmol/L ghrelin的ACSF后，神經(jīng)元放電頻率為（2.63±0.44）Hz，與加藥前相比明顯增加，差異有顯著意義（t=3.55，P<0.05）。隨后，為了驗(yàn)證ghrelin是否通過A型鉀通道發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的，加入A型鉀通道特異性阻斷劑4AP（1 mmol/L），結(jié)果顯示，神經(jīng)元放電頻率增加到（2.71±0.98）Hz，與神經(jīng)元最初的自發(fā)放電頻率相比明顯增加（F=13.21，P<0.01）。應(yīng)用ACSF沖洗腦片，當(dāng)細(xì)胞放電頻率基本恢復(fù)正常以后，同時(shí)給予4AP和ghrelin，結(jié)果顯示，神經(jīng)元放電頻率為（2.74±0.46）Hz，與單獨(dú)應(yīng)用4AP相比差異無顯著性（P>0.05）。

2.2Ghrelin對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元IA幅度的影響

在記錄的5個(gè)神經(jīng)元中，IA的平均電流幅度為（333.68±143.76）pA，應(yīng)用含100 nmol/L ghrelin的ACSF灌流后，IA的電流幅度降低到（153.43±167.87）pA，二者比較差異有顯著意義（t=5.67，P<0.01）。

3討論

A型鉀通道又稱為瞬時(shí)外向型鉀通道，是在黑

質(zhì)DA能神經(jīng)元上廣泛存在的一種電壓依賴型鉀通道，具有較大的電流幅度[7，9，13]。在哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，A型鉀通道由Kv4（KCND13）基因家族形成的α亞基以及KChip（KCNIP14）基因家族形成的輔助β亞基共同組成[1415]，其中Kv4.3/KChip3.1是黑質(zhì)DA能神經(jīng)元上A型鉀通道主要的組成部分[1618]。以往研究證實(shí)，A型鉀通道對(duì)動(dòng)作電位的幅度、時(shí)程和放電頻率發(fā)揮著重要的精細(xì)調(diào)節(jié)作用，阻斷該通道可明顯提高DA能神經(jīng)元的放電頻率[16，1924]。

為了探討ghrelin的細(xì)胞興奮效應(yīng)是否通過抑制IA而實(shí)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)在C57BL/6小鼠腦片的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元上，首先應(yīng)用IA的特異性抑制劑4AP，結(jié)果顯示黑質(zhì)DA能神經(jīng)元興奮性顯著增加；之后再加入4AP與ghrelin混合液，結(jié)果顯示與單獨(dú)應(yīng)用4AP的作用差異無顯著性，說明由于A型鉀通道受到抑制，ghrelin對(duì)DA能神經(jīng)元的作用被抑制，提示ghrelin對(duì)神經(jīng)元興奮性的影響可能是通過抑制A型鉀通道來實(shí)現(xiàn)的。本文實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用加入鈣離子阻斷劑CdCl2和鈉離子阻斷劑TTX的ACSF灌流腦片，之后給予100 nmol/L的ghrelin，觀察到IA的電流幅度明顯降低，從而驗(yàn)證了ghrelin對(duì)A型鉀通道具有抑制作用。

DA能神經(jīng)元是黑質(zhì)致密帶上存在的一種可興奮性神經(jīng)元，在離體腦片記錄中，DA能神經(jīng)元在靜息狀態(tài)下有規(guī)律的自發(fā)放電，放電頻率普遍在1～10 Hz之間[25]。DA能神經(jīng)元的興奮性主要由細(xì)胞靜息膜電位水平和跨膜離子電流的特性決定，有多種離子參與其中，比如鉀離子、鈉離子和鈣離子等，其中電壓依賴型鉀離子通道在維持DA能神經(jīng)元自發(fā)放電等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其中尤以A型鉀通道最為重要[2627]。ghrelin通過提高神經(jīng)元的興奮性，使其釋放到紋狀體內(nèi)的DA含量增加，從而對(duì)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用[1，2729]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，ghrelin對(duì)PD具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[1]。結(jié)合本文結(jié)果，認(rèn)為ghrelin可能通過神經(jīng)保護(hù)和電活動(dòng)調(diào)控兩方面共同改善黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)功能。即ghrelin通過抑制黑質(zhì)DA能神經(jīng)元上的IA，從而提高神經(jīng)元自發(fā)放電頻率，增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性。本文研究結(jié)果為ghrelin在PD中的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，ghrelin在PD的治療中將具有極大的應(yīng)用前景。

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