刁紅亮，田晶，韓志慧，邢培翔，馬瑞燕*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 離石 033000)

昆蟲病原真菌作為一類昆蟲病原微生物，在害蟲生物防治中起著非常重要的作用，其中尤以真菌農(nóng)藥技術(shù)的應(yīng)用效果最為顯著。真菌農(nóng)藥具有寄主范圍廣、對環(huán)境安全、防治害蟲不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，具有廣闊的發(fā)展前景[1]。目前，國內(nèi)外市場上真菌殺蟲劑常見劑型多為以氣生分生孢子為活性物的可濕性粉劑、油懸浮劑和懸浮乳劑等，其中50%以上為可濕性粉劑、懸浮乳劑和水分散粒劑等兌水噴霧使用的水基化應(yīng)用制劑[2]。

開發(fā)真菌殺蟲劑，表面活性劑的選擇是關(guān)鍵。不同劑型中表面活性劑都起著重要作用，如可作為分散劑、乳化劑、潤濕劑等[3]。真菌水基制劑要求不溶于水的活性成分(分生孢子)顆粒均勻分散于水相中，并在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)，形成相對穩(wěn)定的懸浮分散體系，即具有良好的分散懸浮性能。影響分散懸浮性的因素很多，其中具有分散與懸浮作用的表面活性劑(即分散劑)的使用最為關(guān)鍵。分散劑品種選擇合適、質(zhì)量高、用量適當(dāng)，便能夠防止顆粒體之間發(fā)生凝聚，從而使制劑具備良好的分散懸浮性能[4]。分散體系的分散穩(wěn)定性可通過沉降容積、懸浮率、透光率、Zeta電位、動態(tài)光散射(DLS)粒徑測定等方法表征，其中紫外透光率測定具有簡便、快速、穩(wěn)定等特點，常用于懸浮體系顆粒分散穩(wěn)定性的表征[5,6]。

玫煙色棒束孢Isariafumosorosea是一種重要的絲孢類昆蟲病原真菌，可寄生同翅目Homoptera、鱗翅目Lepidoptera、鞘翅目Coleoptera、雙翅目Diptera和膜翅目Hymenoptera昆蟲，是茶樹、蔬菜和果樹害蟲的重要致病真菌之一, 尤其對同翅目蚜蟲、粉虱等刺吸式口器害蟲有很強(qiáng)的致病力[6～9]。該菌分布廣、容易培養(yǎng)、且對人畜安全，是一種重要的生防資源[7]。國外目前已有多種制劑產(chǎn)品面世，約占到所有真菌農(nóng)藥產(chǎn)品的5.9%[10]，如荷蘭的Biocon?和Biobest?，美國和歐洲的芽生孢子制劑PFR97?等[6,10]。目前，國內(nèi)玫煙色棒束孢研究工作已取得不少進(jìn)展，但尚未實現(xiàn)大規(guī)模的開發(fā)和應(yīng)用[9]。

本文以玫煙色棒束孢IF1106菌株氣生分生孢子水懸浮液為研究對象，通過測定孢子懸浮液的紫外透光率，篩選表面活性劑的種類及用量，并對表面活性劑復(fù)配方案進(jìn)行正交優(yōu)化，以探索具有較高分散懸浮性能的表面活性劑方案，為進(jìn)一步開發(fā)高性能玫煙色棒束孢生防殺蟲劑奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌株

玫煙色棒束孢IF1106菌株，保藏編號：CGMCC NO.1396，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物安全與生物防治研究組實驗室提供。

1.1.2供試表面活性劑

供試表面活性劑見表1。

表1　供試表面活性劑Table 1　Surfactants evaluated in this study

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖200 g、瓊脂17 g、加蒸餾水至1 L。

1.1.4儀器

生物顯微鏡，CX31，奧林巴斯中國有限公司；滅菌鍋，LS-75HD，濟(jì)南歐迪醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺， SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；滅菌噴霧器，ASONE500 mL，日本ASONE株式會社；霉菌培養(yǎng)箱，BPMJ-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，GZX-GF-II，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；氣流粉碎機(jī)，F(xiàn)DV，北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；電動振篩機(jī)，XF200，上海振篩機(jī)械設(shè)備有限公司；酸度計，STRATER 2100/3C PRO，奧豪斯儀器(上海)有限公司；高剪切乳化機(jī)，AD500S-P，上海昂尼儀器儀表有限公司；紫外-可見分光光度計，UV-1 902 A，上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.2　方法

1.2.1菌株分生孢子懸浮液的制備

將活化后玫煙色棒束孢 IF1106 菌株接種在 PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃ 條件下培養(yǎng)10 d，用滅菌過的蓋玻片刮取孢子，加入適量的無菌水，用磁力攪拌器攪拌30 min，用滅菌四層紗布過濾掉菌絲，顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×107孢子·mL-1。

1.2.2菌株孢子粉的制備

取大米500 g，加水浸泡10～12 h后瀝干水分滅菌，在無菌條件下將滅菌后的大米加入適量無菌水并平鋪于托盤中，形成米飯培養(yǎng)基。使用滅菌噴霧器將上述IF1106孢子懸浮液均勻噴灑在米飯培養(yǎng)基表面，用保鮮膜覆蓋密封并置于25 ℃、12 L∶12 D光周期的霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d產(chǎn)孢。

將產(chǎn)孢后的托盤揭去保鮮膜，放置于26 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥30～40 h，再在35 ℃下干燥，使物料整體水分含量低于5%。將干燥后的物料置于氣流粉碎機(jī)進(jìn)行間歇式粉碎，每次粉碎30 s間隔20 min，共粉碎3～5次，使用電動振篩機(jī)將粉碎后物料過400 目篩形成孢子粉備用。

1.2.3孢子懸浮液的制備

取1 g玫煙色棒束孢IF1106的孢子粉置于150 mL錐形瓶中，稱取一定量(相對被分散物料的質(zhì)量百分比)的表面活性劑加入錐形瓶中，并加入100 mL去離子水，以玻璃棒攪拌均勻形成懸浮液，以酸度計測量懸浮液的pH值， 以5%NaOH溶液調(diào)整pH值至7～8。

1.2.4孢子懸浮液透光率測定

將以上孢子懸浮液置于高剪切乳化機(jī)下，懸浮液液面高于分散頭，打開高剪切乳化機(jī)的開關(guān)，將轉(zhuǎn)速調(diào)為四格(約600 r·min-1)，剪切1 min。

打開紫外-可見光分光光度計預(yù)熱 20 min，在第一個比色皿中裝參比溶液(等量分散劑溶液，不含有孢子粗粉，其透過率為 100%)作為背景處理，將乳化后的孢子懸浮液(原液或稀釋液)加入比色皿中，在環(huán)境溫度25 ℃和600 nm入射光條件下測定分散體系的透光率并記錄數(shù)據(jù)。將以上乳化后的孢子懸浮液靜置30 min，同樣條件下測定體系透光率并記錄數(shù)據(jù)，每次測量做3次重復(fù)。

1.2.5試驗數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗所有數(shù)據(jù)均使用DPS7.05軟件進(jìn)行分析與處理，采用OriginPro8軟件繪制不同分散體系透光率與表面活性劑濃度曲線圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　表面活性劑用量對孢子懸浮液透光率的影響

在孢子懸浮液中加入不同用量的4類(非離子、陰離子、高分子和有機(jī)硅表面活性劑)10種表面活性劑對分散體系透光率的影響見圖1～圖4。

圖1　非離子表面化活性劑用量對孢子懸浮液透光率的影響Fig.1　Effect of amount of non-ionic surfactant on the transmittance of conidial suspension

圖2　陰離子表面化活性劑用量對孢子懸浮液透光率的影響Fig.2　Effect of amount of anionic surfactant on the transmittance of conidial suspension

圖3　高分子表面化活性劑用量對孢子懸浮液透光率的影響Fig.3　Effect of amount of polymeric surfactant on the transmittance of conidial suspension

圖4　有機(jī)硅表面化活性劑用量對孢子懸浮液透光率的影響Fig.4　Effect of amount of organosilicon surfactant on the transmittance of conidial suspension

從圖1可以看出，隨著孢子懸浮液中表面活性劑用量的增加，體系透光率變化趨勢存在明顯差異。其中使用BY-110的孢子懸浮液隨著表面活性劑用量的增加，靜置0 min和30 min的懸浮液透光率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。當(dāng)加入量在10%～30%時透光率變化較為平緩，且2條曲線逐漸接近。加入量大于30%時，靜置0 min和30 min懸浮液透光率都又開始逐漸上升。

相關(guān)研究認(rèn)為，微粒懸浮液靜置時間0 min時的透光率反映了顆粒分散性的好壞，顆粒分散越好，粒徑越小，顆粒之間的距離越小，光被吸收和散射的就多，能穿透的較少，則透光率越小，反之，則越大。隨時間增加，由于樣品之間分散性的差異導(dǎo)致其團(tuán)聚程度不同，團(tuán)聚越嚴(yán)重，顆粒的粒徑越大，沉降的也就越快，上清液中顆粒濃度減少越快，透光率也就增加越快[6]。因此，本文中的孢子懸浮液靜置0 min的透光率反映了分散體系的分散性，而靜置30 min的透光率則反映了體系的懸浮穩(wěn)定性。

基于以上表明：使用BY-110可有效提高孢子懸浮液的分散性與懸浮穩(wěn)定性，且當(dāng)使用量在10%～30%時，孢子懸浮液可獲得較高的分散性和懸浮穩(wěn)定性。使用ST-100和EL-40的孢子懸浮液隨著表面活性劑量的增加，靜置0 min和30 min的懸浮液透光率沒有出現(xiàn)下降趨勢，且兩條曲線彼此分離較遠(yuǎn)。這表明使用ST-100和EL-40沒有有效改善孢子懸浮液的分散性與懸浮穩(wěn)定性。

同樣由圖2～圖4可知，單獨使用陰離子表面活性劑AOS(加入量20%～40%)、高分子表面活性劑CMC-Na(加入量15%～35%)、有機(jī)硅表面活性劑2230(加入量10%～30%)可有效提高孢子懸浮液的分散性與懸浮穩(wěn)定性。

2.2　孢子懸浮液表面活性劑方案的正交優(yōu)化

單獨使用一類表面活性劑作為分散劑普遍存在添加量大，分散效率低、穩(wěn)定性差等問題，而不同種類表面活性劑的復(fù)配使用可在保證各自發(fā)揮其作用的同時又能夠相互協(xié)同，從而極大提高分散微粒體系的分散效率和穩(wěn)定性[12]?；诖?，本文以上述試驗篩選出的4種表面活性劑作為制備玫煙色棒束孢IF1106孢子懸浮液的分散劑，通過測量懸浮液透光率(原懸浮液稀釋10倍測量)并進(jìn)行正交試驗優(yōu)化表面活性劑復(fù)配方案。

2.2.1正交設(shè)計

依據(jù)表面活性劑篩選試驗結(jié)果，以BY-110(非離子)、AOS(陰離子)、2230(有機(jī)硅)、CMC-Na(高分子)4種表面活性劑為實驗因素，并選取每種表面活性劑在10%～40%范圍內(nèi)的5個用量為水平，具體表面活性劑方案正交優(yōu)化試驗因素水平見表2。

2.2.2正交試驗表及孢子懸浮液透光率測定結(jié)

因本試驗考察4個因素在5個水平上對形成的懸浮液(稀釋液)透光率的影響，不考察因素間的交互作用，故選用L25(56)正交表。正交試驗表及孢子懸浮液透光率測定結(jié)果見表3。

2.2.3正交試驗結(jié)果極差分析

表2　試驗因素水平表Table 2　Test factor level table.

表3　正交實驗表及孢子懸浮液透光率測定結(jié)果Table 3　Orthogonal experimental table and the determination of the transmittance of conidial suspension

表4　懸浮液靜置0 min透光率試驗因子值Ki和分析結(jié)果Table 4　Test Factor Ki and of the transmittance of conidial suspension static 0 min

表5　懸浮液靜置30 min透光率(分散性)試驗因子水平指標(biāo)Ki和值和分析結(jié)果Table 5　Test Factor Ki and of the transmittance of conidial suspension static 0 min

靜置0 min和靜置30 min的透光率分別反映了懸浮液顆粒的分散性能與懸浮性能。極差分析給出二者的最優(yōu)表面活性劑方案略有不同，這表明表面活性劑在懸浮液體系中的分散和穩(wěn)定作用存在差異，適當(dāng)增加高分子表面活性劑的用量可有效改善分散體系的懸浮穩(wěn)定性。

懸浮液透光率因子極差R分析結(jié)果見表6。從表中可以看出，靜置0 min試驗因子影響力的主次排序為DCAB，其中D為主要因子，C、A、B為次要因子。靜置30 min試驗因子影響力的主次排序為DACB，其中D為主要因子，A、C、B為次要因子。

表6　懸浮液透光率因子極差分析結(jié)果Table 6　Factor range analysis result of the transmittance of conidial suspension

以因子的水平做橫坐標(biāo)，指標(biāo)的平均值作縱坐標(biāo)，繪制因子與指標(biāo)關(guān)系趨勢圖(圖5)，從圖可以看出試驗指標(biāo)(試驗結(jié)果)隨水平變化趨勢。靜置0 min孢子懸浮液而言最優(yōu)水平組合為A2B3C1D1，試驗因素影響力的主次排序為DCAB；靜置30 min孢子懸浮液而言最優(yōu)水平組合為A2B3C1D2，試驗因素影響力的主次排序為DACB。

綜上所述，得到基于懸浮液分散性的最優(yōu)表面活性劑方案為A2B3C1D1，即表面活性劑復(fù)配方案：BY-110(15%)、AOS(30%)、2230(10%)、CMC-Na(15%)；得到基于懸浮液懸浮性的表面活性劑方案為A2B3C1D2，即表面活性劑復(fù)配方案：BY-110(15%)、AOS(30%)、2230(10%)、CMC-Na(20%)。

圖5　懸浮液透光率試驗因子與響應(yīng)指標(biāo)關(guān)系趨勢圖Fig.5　Relationship between the test factor and the response index of transmittance of conidial suspension

3　討論

在微生物活體農(nóng)藥開發(fā)研究中，配套制劑技術(shù)研究是其產(chǎn)品開發(fā)和推廣應(yīng)用的重要基礎(chǔ)[13]。適合作為微生物源農(nóng)藥的劑型很多，其中可濕性粉劑和水分散粒劑均為固體劑型且需要兌水形成噴霧液使用，具有水基型制劑和固體制劑的雙重優(yōu)點[14]，它既避免了液體制劑運輸貯存不便的缺點，又克服了粉劑、細(xì)顆粒劑等藥效差和施用不便的缺陷，是目前微生物農(nóng)藥最為常見的劑型。

真菌殺蟲劑是以蟲生真菌分生孢子為活性物的活體微生物源農(nóng)藥，由于分生孢子表面具有較強(qiáng)的疏水性，因此其制劑加工難度普遍高于化學(xué)農(nóng)藥[15]。開發(fā)真菌可濕性粉劑或水分散粒劑，要求制劑兌水稀釋后能夠形成較為穩(wěn)定的懸浮液，不易堵塞噴頭且噴霧均勻。分散均勻懸浮穩(wěn)定的孢子懸浮液的形成主要依賴表面活性劑的使用。具有分散穩(wěn)定作用的表面活性劑能夠使固體顆粒在水相中長時間保持均勻分散，并阻止固液兩分散系中固體顆粒相互凝集結(jié)團(tuán)[4]，其作用機(jī)理在于表面活性劑分子可吸附在固體粒子表面，在粒子周圍形成電荷或空間位阻勢壘，從而起到阻止粒子之間相互靠近聚集并最終沉降的作用。

真菌制劑兌水稀釋后形成的孢子懸浮液屬于粒子低濃度分散懸浮體系，如何準(zhǔn)確表征孢子粉顆粒兌水后短時間內(nèi)的分散行為是選擇分散劑的關(guān)鍵。紫外透光率測定常用于各種分散體系顆粒分散行為的表征[5,6,16～18]，可直觀準(zhǔn)確揭示分散相在水中的分散與沉降行為。本文以懸浮體系透光率測定作為依據(jù)，篩選出對玫煙色棒束孢孢子粉具有良好分散穩(wěn)定作用的表面活性劑并進(jìn)行了復(fù)配方案的正交優(yōu)化，基于懸浮液分散穩(wěn)定性給出了優(yōu)化的表面活性劑方案，同時顯示出高分子和非離子表面活性劑是玫煙色棒束孢孢子懸浮液分散穩(wěn)定性的主要影響因素。

高分子表面活性劑具有較大的分子量，高分子鏈可在分散介質(zhì)中充分伸展形成吸附層，從而產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，雖然高分子表面活性劑到粒子表面的擴(kuò)散過程較慢，但其吸附能力強(qiáng), 不易從表面轉(zhuǎn)移, 能提供優(yōu)良的分散穩(wěn)定性[20,21]。同時，高分子和其他表面活性劑之間能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，表現(xiàn)為復(fù)合體系比單一表面活性劑或高分子體系具有更優(yōu)異的性能，例如高分子可與非離子表面活性劑發(fā)生締合作用而展現(xiàn)出更高的表面活性[22]。有機(jī)硅表面活性劑的疏水基團(tuán)是由烷基硅氧烷主鏈所組成，其疏水性能比傳統(tǒng)的碳鏈烴類表面活性劑更強(qiáng)，其溶液對疏水界面表現(xiàn)出更優(yōu)良的展著性、潤濕性、滲透性，能極大地促進(jìn)藥液擴(kuò)展，因此常用作噴霧助劑和葉面吸收助劑[23,24]，同時疏水端易水解產(chǎn)生硅羥基的有機(jī)硅表面活性劑具有一定的分散作用[25]。

4　結(jié)論

本研究以懸浮液透光率測定，從懸浮液分散和懸浮穩(wěn)定性的角度對應(yīng)用于玫煙色棒束孢孢子懸浮液的表面活性劑進(jìn)行了篩選，明確了單獨使用非離子表面活性劑BY-110(加入量10%～30%)、陰離子表面活性劑AOS(加入量20%～40%)、高分子表面活性劑CMC-Na(加入量15%～35%)、有機(jī)硅表面活性劑2230(加入量10%～30%)可獲得具有較好分散與懸浮穩(wěn)定性的孢子懸浮液，同時對以上表面活性劑的復(fù)配方案進(jìn)行了正交優(yōu)化，結(jié)果表明：具有較高分散性的表面活性劑復(fù)配方案為BY-110(15%)、AOS(30%)、2230(10%)、CMC-Na(15%)；具有較高懸浮穩(wěn)定性的表面活性劑復(fù)配方案為BY-110(15%)、AOS(30%)、2230(10%)、CMC-Na(20%)。