臧　凱,羅小光,李　偉,陳　睿,周睿嫻

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

更年期是女性從生育旺盛的性成熟階段向非生育階段的衰老過(guò)程，在此期間由于女性內(nèi)分泌改變，雌激素水平波動(dòng)或減少，下丘腦-垂體-卵巢軸平衡失調(diào)，出現(xiàn)一系列以植物神經(jīng)功能代謝紊亂的一組癥候群，稱為更年期綜合癥(Menopausal Syndrome,MPS)[1]。研究顯示[2]，約84%女性不能通過(guò)機(jī)體自我調(diào)節(jié)達(dá)到神經(jīng)內(nèi)分泌新的平衡而出現(xiàn)更年期綜合癥相關(guān)癥狀。隨著社會(huì)人口結(jié)構(gòu)老齡化，該病有發(fā)病年齡提早、發(fā)病率上升的趨勢(shì)[3]。MPS雖不危及生命，但其癥狀反復(fù)發(fā)作、持續(xù)時(shí)間或長(zhǎng)或短，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且遠(yuǎn)期可導(dǎo)致冠心病、高血壓、骨質(zhì)疏松、糖尿病、阿爾茲海默癥等疾病的發(fā)生[4]。因此對(duì)其早期預(yù)防和及時(shí)診治,使患者平穩(wěn)度過(guò)更年期有重要意義。在臨床工作中運(yùn)用穴位注射和中藥茶治療更年期取得了較滿意的效果，但其作用機(jī)制尚未明確，故本課題采用SD大鼠建立更年期動(dòng)物模型模擬女性卵巢功能逐漸衰竭的過(guò)程，在此基礎(chǔ)上觀察穴位注射和中藥茶對(duì)血液流變學(xué)以及對(duì)雌性激素、子宮形態(tài)學(xué)的影響，為臨床應(yīng)用及早期預(yù)防治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取3月齡雌性未孕SD大鼠156只，體質(zhì)量(250±20)g，貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黔)2002-0001。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床試驗(yàn)中心-SPF級(jí)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2　實(shí)驗(yàn)藥物

中藥方劑:自制茶方，符合《中國(guó)藥典》2010年版項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)(由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供)，組成: 紅花、玫瑰花、金銀花各12 g,佛手10 g,合歡皮15 g,浮小麥12 g,菟絲子、旱蓮草、枸杞各15 g,菊花12 g,百合15 g，水煎,4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；丹紅注射液(山東丹紅制藥有限公司,產(chǎn)品批號(hào)：16012001,20 mL/支);10%水合氯醛(貴州醫(yī)科大學(xué)自制)；80萬(wàn)單位注射用青霉素鈉(中諾藥業(yè),產(chǎn)品批號(hào)：017150442)。

1.3　實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑：雌二醇E2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；卵泡刺激素FSH酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。儀器：JY2001電子計(jì)重稱(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)；MSE-25型臺(tái)式大型高速冷凍離心機(jī)(廣州市流式生物科技有限公司)；LBY -N6K型血液粘度計(jì) (北京普利生有限公司)；BCD-215WDGC立式低溫冷藏箱(青島海爾有限公司)。

1.4　實(shí)驗(yàn)分組

將156只實(shí)驗(yàn)大鼠，隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組，常規(guī)飼養(yǎng)。其他分為3大組群：次切組群、次全切組群和全切組群(每個(gè)組群里分別包含：模型組、中藥茶組、穴位注射組和中藥茶+穴位注射組4個(gè)小組，每組各12只)。

1.5　造模

禁食不禁水24 h后，按0.3 mL/100 g的劑量標(biāo)準(zhǔn)予10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹部剪毛、消毒后逐層切開(kāi)暴露腹腔。次切組群：右側(cè)卵巢全切，左側(cè)卵巢切除約50%；次全切組群：右側(cè)卵巢全切，切除左側(cè)卵巢體積約80%；全切組群：切除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組：不切除卵巢，僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后連續(xù)3天予青霉素注射液肌注預(yù)防感染,術(shù)后1周開(kāi)始行陰道涂片檢查，1次/天，連續(xù)5天。次切組群：以角化上皮細(xì)胞指數(shù)≤50%為造模成功；次全切組群：以角化上皮細(xì)胞指數(shù)≤30%為造模成功；全切組群：以不出現(xiàn)角化上皮細(xì)胞為造模成功。

實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中假手術(shù)組大鼠死亡2只;次切組群大鼠共死亡5只,造模失敗剔除3只;次針刀組群大鼠共死亡4只,造模失敗剔除4只;全切組群大鼠共死亡7只,造模失敗剔除1只。故最后每小組各10只。

1.6　干預(yù)治療

中藥茶組:自由飲藥，飲用8周。穴位注射組：根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜提供的定位方法，選取腎俞(雙)、肝俞(雙)、氣海、關(guān)元，注射丹紅注射液0.02 mL/穴，1周1次，共8次。中藥茶+穴位注射組：方法同上，聯(lián)合治療。假手術(shù)組與各模型組: 自由飲食，無(wú)干預(yù)措施。

1.7　檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.7.1E2、FSH的標(biāo)本收集與測(cè)定治療結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血4 mL，提取血清，-20℃冰箱保存待測(cè)，血清雌二醇(E2)、卵泡雌激素(FSH)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)，具體按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7.2血液流變學(xué)測(cè)定取4 mL血液于抗凝管內(nèi)，立即搖勻后送往貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室由該科專人檢測(cè)血液流變學(xué)。

1.7.3子宮組織形態(tài)變化大鼠處死后，取子宮組織用10%的福爾馬林液固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　血清E2、FSH水平比較

與假手術(shù)組相比，各模型組E2均下降，F(xiàn)SH均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功；觀察各模型組、次切組、次全切組及全切組E2呈依次遞減趨勢(shì)，F(xiàn)SH呈依次遞增趨勢(shì)，這一過(guò)程體現(xiàn)了卵巢功能漸衰。與模型組比較，各治療組大鼠E2均明顯升高，F(xiàn)SH均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示穴位注射和中藥茶均能提高去勢(shì)大鼠E2水平，降低FSH水平，其中以次切中藥茶+穴位注射組雌激素水平改善更為明顯。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠E2、FSH比較

2.2　全血粘度的比較

與假手術(shù)組相比，各模型組全血粘度(高、中、低切變率)均明顯升高(P<0.01)。治療后與模型組比較，各治療組全血粘度(高、中、低切變率)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示穴位注射和中藥茶均能降低去勢(shì)大鼠不同切變率下全血粘度，其中以次切中藥茶+穴位注射組全血粘度改善更好,見(jiàn)表2。

2.3　血漿粘度的比較

各模型組血漿粘度較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)；治療后治療組血漿粘度均明顯下降(P<0.01)，提示穴位注射和中藥茶均能改善去勢(shì)大鼠血漿粘度，其中以次切中藥茶+穴位注射組血漿粘度改善更好，見(jiàn)表2。

2.4　紅細(xì)胞壓積的比較

與假手術(shù)組相比，各模型組紅細(xì)胞壓積均升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組的紅細(xì)胞壓積均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示穴位注射和中藥茶均能降低去勢(shì)大鼠紅細(xì)胞壓積，以次切中藥茶+穴位注射組改善更好。見(jiàn)表2。

2.5　子宮組織形態(tài)學(xué)病理變化

假手術(shù)組：子宮內(nèi)膜以高柱狀上皮為主，腺體多，血管豐富。各模型組：子宮內(nèi)膜多為單層扁平上皮，呈不同程度萎縮組織象，腺體數(shù)目和血管稀少。各治療組均能使子宮內(nèi)膜上皮增厚，間質(zhì)致密，腺體和血管數(shù)量增多；其中次切組群治療組大鼠子宮內(nèi)膜改善情況優(yōu)于次全切組群及全切組群治療組大鼠。中藥茶：子宮內(nèi)膜多為單層柱狀上皮，腺體數(shù)目稍多，血管增加。穴位注射組：子宮內(nèi)膜以單層柱狀上皮為主，固有層腺體和血管數(shù)目增多，但不如中藥茶+穴位注射組明顯。中藥茶+穴位注射組：子宮內(nèi)膜厚度明顯增加，被覆單層柱狀上皮，腺體數(shù)目明顯增多，分泌較好，間質(zhì)致密，血管較豐富。見(jiàn)封三彩圖1。

表2　各組大鼠血液流變學(xué)比較

3　討論

目前更年期動(dòng)物模型以去勢(shì)模型[6]最為常用，但其體內(nèi)雌激素水平是突然下降的，與人類更年期卵巢功能漸衰雌激素分泌功能逐漸降低的過(guò)程有著本質(zhì)的不同。為了更貼切描述更年期生理變化特征，故本實(shí)驗(yàn)采取右側(cè)卵巢全部摘除，左側(cè)卵巢分別摘除50%、80%、100%的造模方法來(lái)模擬卵巢功能漸衰的過(guò)程。結(jié)果表明：與假手術(shù)組相比，各模型組大鼠E2水平均降低，F(xiàn)SH水平均升高，與女性更年期內(nèi)分泌水平變化一致，提示大鼠進(jìn)入更年期；次切、次全切及全切模型組FSH水平呈升高趨勢(shì)，而E2水平呈下降趨勢(shì),大致模擬了卵巢功能逐漸衰退的過(guò)程。同時(shí)檢測(cè)大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)及陰道脫落細(xì)胞均有更年期變化，進(jìn)一步表明成功地復(fù)制了更年期漸衰大鼠模型，但由于樣本量少不能明確處于更年期具體哪個(gè)時(shí)期，只能粗略地模擬人類更年期的生理變化特征。

現(xiàn)代醫(yī)家[7-9]認(rèn)為，除肝腎虧虛外，血瘀也是更年期的一個(gè)重要病機(jī)。婦女七七天癸竭，沖任虧虛，臟腑氣血陰陽(yáng)平衡失調(diào)，氣機(jī)不暢、血行無(wú)力、脈道失和，從而影響氣血運(yùn)行，致血流瘀阻。更年期綜合癥以肝腎虧虛為致病之本，血瘀為標(biāo)，而血瘀作為病理產(chǎn)物同時(shí)也是致病因素，影響機(jī)體功能和狀態(tài)?，F(xiàn)代研究也表明，更年期與血液流變學(xué)之間有著互為因果的內(nèi)在聯(lián)系[10]，女性進(jìn)入更年期時(shí)，性激素水平明顯下降的同時(shí)出現(xiàn)血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)的改變，血液呈不同程度的“稠、粘、聚、凝”狀態(tài)，結(jié)合更年期后女性心血管等疾病的發(fā)病率逐漸升高,說(shuō)明更應(yīng)重視血瘀的病理變化。此外，雌激素是女性最重要的性激素，對(duì)心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等有重要保護(hù)作用[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：與假手術(shù)組相比，各模型組大鼠血液流變學(xué)全血粘度、血漿粘度及紅細(xì)胞壓積明顯增高，大鼠血液處于高黏、高聚、高凝狀態(tài)，這也與女性更年期病理變化相一致。經(jīng)治療后，與各模型組相比，各治療組大鼠血清中E2水平明顯上升，全血粘度、血漿粘度及紅細(xì)胞壓積水平顯著下降，其中以次切治療組群療效最佳，說(shuō)明穴位注射和中藥茶均能提高去勢(shì)雌性大鼠的雌激素水平，降低去勢(shì)大鼠血液流變學(xué)的異常水平，且在卵巢漸衰的過(guò)程中，早期干預(yù)治療有效。根據(jù)女性更年期的主要病機(jī), 以調(diào)理臟腑、平衡陰陽(yáng)為治療法則，穴取腎俞、肝俞、氣海、關(guān)元穴進(jìn)行穴位注射。腎俞、肝俞為背俞穴，為臟腑氣血輸注的部位，能調(diào)肝補(bǔ)脾滋腎。氣海、關(guān)元穴歸屬任脈，又與沖脈相通，可補(bǔ)益沖任、調(diào)經(jīng)理宮、調(diào)血補(bǔ)氣。丹紅注射液有活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效，由丹參和紅花組成，丹參活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛、清心除煩、養(yǎng)血安神；紅花性溫、味辛，能通經(jīng)散瘀、活血止痛。研究證實(shí)二者在含藥血清中均具有雌激素樣活性[12]，能在一定程度上調(diào)節(jié)更年期的激素水平紊亂。穴位注射療法通過(guò)中醫(yī)經(jīng)穴-臟腑相關(guān)體系注射給藥,將經(jīng)絡(luò)、腧穴、藥物效應(yīng)相結(jié)合，綜合穴效和藥效，以“疏其氣血、令其條達(dá)”通過(guò)改善卵巢子宮組織的血液供應(yīng)，維持卵巢分泌雌激素的功能，從而防治更年期綜合征。中藥茶方以紅花活血化瘀、散郁開(kāi)結(jié)，配以枸杞、菟絲子、旱蓮草以補(bǔ)腎益肝、養(yǎng)精安神，佛手、合歡皮、玫瑰花、菊花疏肝理氣解郁，浮小麥、百合寧心安神，共奏滋養(yǎng)肝腎、交通心腎、調(diào)和氣血、調(diào)整臟腑之功效。中藥茶方[13]以沸水為溶劑,既能防止成分揮發(fā)或酶解損失,又可使有效成分充分溶出；本茶方多采用花藥，口感較傳統(tǒng)中藥方香甜，既具有中藥復(fù)方的功效，又能發(fā)揮藥物雌激素樣作用，并減少了煎煮及服用中的不便之處，操作簡(jiǎn)單方便，更符合現(xiàn)代人的生活方式。

綜上，穴位注射和中藥茶可能通過(guò)降低血液粘稠度，改善卵巢子宮組織血液供應(yīng)，維持卵巢分泌雌激素功能而提高去勢(shì)大鼠E2水平，降低FSH水平，改善子宮組織形態(tài)從而治療更年期。在卵巢漸衰的過(guò)程中，越早進(jìn)行干預(yù)治療，療效更佳，為臨床應(yīng)用和早期干預(yù)治療提供了理論依據(jù)。