朱志春 鄭毅

摘 要：以類球紅細(xì)菌NM-FZ-47為出發(fā)菌株，采用紫外線和NTG2種誘變，利用疊氮鈉、對羥基苯甲酸、羅紅霉素及卡那霉素等抗性篩選因子，實現(xiàn)快速推理選育輔酶Q10高產(chǎn)菌株，成功構(gòu)建了2個正突變庫，并從庫中篩選出產(chǎn)量提高15%以上的6株輔酶Q10突變株UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、NTG-LN-67，作為進(jìn)一步基因組改組育種的出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：誘變育種；推理選育；正突變庫

中圖分類號 S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）10-0018-03

輔酶Q10（CoQ10）又稱為泛醌，作為一種重要生物活性物質(zhì)，具備豐富生理功能，近年來隨著人們保健意識提高，需求量不斷增加[1-2]。CoQ10的生產(chǎn)方法一般分為直接提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法等[3]。微生物發(fā)酵法具有原料便宜、易分離、產(chǎn)物天然、無手性問題、易被人體吸收等優(yōu)勢，同時容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ腃oQ10生產(chǎn)方法。類球紅細(xì)菌（Rhodobacter phaeroides）是最重要的輔酶Q10產(chǎn)生菌[4]，菌株的生產(chǎn)性能是影響發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10成本重要因素，本研究擬通過紫外線與NTG誘變育種的手段，結(jié)合抗性因子推理育種手段，實現(xiàn)快速選育高產(chǎn)菌株的目標(biāo)，分別構(gòu)建紫外線與NTG誘變正突變庫，為進(jìn)一步基因組改組育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 類球紅類球NM-FZ-47為本實驗室保藏菌株

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 從斜面挑取一環(huán)，進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)（32℃、7d）；挑取平板單菌落接入種子培養(yǎng)基（裝液量25mL/250mL三角瓶）培養(yǎng)（32℃、220rpm、24h），制成液體種子；接種量為20%（V/V），液體種接入發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶）培養(yǎng)（32℃、220rpm、24h）。

1.2.2 CoQ10的檢測 采用HPLC法檢測CoQ10的濃度[5]。

1.2.3 紫外誘變和NTG誘變正突變庫構(gòu)建

1.2.3.1 紫外誘變正突變庫構(gòu)建 菌懸液（細(xì)胞濃度為106個/mL），經(jīng)紫外線照射一定時間，然后冰浴穩(wěn)定5min，在紅燈下稀釋涂布，32℃培養(yǎng)7d后，挑選突變菌落，進(jìn)一步定向初篩、復(fù)篩，構(gòu)建紫外線誘變正突變庫。

1.2.3.2 NTG誘變劑正突變庫構(gòu)建 菌懸液（細(xì)胞濃度為106個/mL），經(jīng)一定工作濃度NTG振蕩處理18min后，稀釋涂布，32℃培養(yǎng)7d后，挑選突變菌落，進(jìn)一步定向初篩、復(fù)篩，構(gòu)建NTG誘變正突變庫。

1.2.4 抗性因子快速推理選育CoQ10正突變株 將紫外和NTG誘變獲得突變菌落，通過羅紅霉素、對羥基苯甲酸（PHB）、疊氮鈉和卡那霉素4種抗性因子脅迫選擇，實現(xiàn)定向快速篩選CoQ10高產(chǎn)菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變劑量的確定

2.1.1 紫外誘變最適劑量 以照射時間作為紫外線誘變的劑量，分別改變照射時間0s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s，90s，獲得紫外誘變致死曲線，結(jié)果如圖1。當(dāng)照射70s時，致死率已達(dá)到100%，由于是初次誘變，根據(jù)經(jīng)驗選擇致死率為75%的致死劑量，由圖可知紫外線照射時間為50s。

2.1.2 NTG誘變最適劑量 分別改變NTG工作濃度0，0.2，0.4，0.5，0.8mg/L，獲得NTG誘變致死曲線，結(jié)果見圖2。當(dāng)NTG濃度為0.6mg/mL時，致死率已達(dá)99%，由于是初次誘變，根據(jù)經(jīng)驗選擇致死率為75%的致死劑量，由圖可知NTG工作濃度為0.4mg/mL。

2.2 抗性因子推理選育CoQ10正突變株 根據(jù)CoQ10的生理功能，利用抗性因子篩選作用，實現(xiàn)定向推理選育高產(chǎn)菌株。CoQ10具有清除自由基的作用，而羅紅霉素易與氧分子結(jié)合發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移形成超氧陰離子，CoQ10還原性能夠有效抑制卡那霉素的氧化作用，有效解毒疊氮鈉對呼吸鏈的抑制作用，所以菌體對羅紅霉素、卡那霉素、疊氮鈉抗性越高，菌體合成CoQ10能力越高[5-7]。PHB[8-9]作為CoQ10生物合成的前體，如果菌體對PHB抗性越強(qiáng)，說明菌體解除PHB前體合成反饋抑制作用，更有利菌體合成CoQ10。因此利用4個抗性因子定向篩選作用，可實現(xiàn)CoQ10的高產(chǎn)菌株的快速篩選。

2.2.1 抗性因子脅迫濃度 初始抗性因子篩選濃度太低起不到脅迫作用，太高起不到篩選作用，通過改變平板培養(yǎng)基中抗性因子濃度，使出發(fā)菌株在平板上無法生長的臨界濃度，作為抗性因子脅迫濃度。改變平板培養(yǎng)基羅紅霉素、卡那霉素、PHB及疊氮鈉濃度，獲得抑制菌體生長的臨界濃度，結(jié)果如表1，獲得4種抗性因子篩選脅迫濃度。

2.2.2 抗性因子篩選效應(yīng)的分析 經(jīng)紫外誘變和NTG誘變后，通過4種抗性因子的定向篩選后，分析正突變率與提高幅度，用于分析2種誘變方法的誘變效應(yīng)用與4種篩選因子的篩選效應(yīng)，結(jié)果見表2、表3。2種誘變劑誘變效應(yīng)分析，NTG誘變正突變率及最大提高幅度都比紫外線誘變高，NTG誘變的正突變率最高為39.78%，最高產(chǎn)量達(dá)到77.68mg/L，較出發(fā)菌株提高了27.15%。4種抗性因子篩選效應(yīng)分析，疊氮鈉篩選效果最明顯，紫外誘變與NTG誘變中，疊氮鈉的正突變率分別為32.54%和39.78%，最大提高幅度分別為22.5%和27.15%。CoQ10作為一種電子傳遞體，其大量合成可以有效解除疊氮鈉呼吸抑制作用，基于此機(jī)理，疊氮鈉作為篩選因子具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

將誘變育種提高15%的正突變株作為基因組改組的正突變庫，進(jìn)一步復(fù)篩及穩(wěn)定性研究，獲得UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、NTG-LN-67這6組菌株，結(jié)果如表4。但這6組菌株誘變手段與篩選因子組合不同，因此利用這6組菌株作為基因改組育種初始菌株，提供不同類型正突變基因。

3 結(jié)論

利用紫外和NTG誘變，結(jié)合羅紅霉素、卡那霉素、PHB及疊氮鈉抗性因子的定向篩選，推理選育構(gòu)建類球紅細(xì)菌輔酶Q10正突變庫，最終成功篩選出6株遺傳背景不同正突變株，作為基因組改組育種的出發(fā)菌株，大大提高了輔酶Q10產(chǎn)量。

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