婁云云

（協(xié)和干細胞基因工程有限公司，天津 300384）

間充質干細胞具有自我更新和多向分化以及強烈的免疫調節(jié)功能，同時，其免疫原性低，在治療多種血液病的異基因造血干細胞移植后發(fā)生的移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、糖尿病、克隆氏病等疾病治療中均顯示出良好效果[1-2]。臍帶間充質干細胞的來源為易得、變廢為寶的臍帶，因而受到越來越多研究者的關注，并大量從基礎研究轉入臨床應用。臨床使用細胞產品其治療的有效成分為鮮活的干細胞，就必須從其生產，保存，運輸等所有環(huán)節(jié)保證干細胞的活性，因而我們專門針對臍帶間充質干細胞制劑保存的質量參數做了試驗。

1 材料及方法

臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，經培養(yǎng)提取后，置于含2%人血白蛋白、65 IU/mL低分子肝素鈣和復方電解質注射液的干細胞保存液，制成臍帶間充質干細胞注射液三批成品，標記為17121801、17121802、17121803。分別在室溫（23 ℃）和4 ℃條件下保存。并均于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h抽樣，對其進行物理檢查和細胞存活率測定，并進行無菌檢測。

2 試驗檢測

性狀：目測應無色均勻細胞懸液，無明顯沉淀，無異物為合格。

細胞活率檢測：采用Count star自動細胞計數儀進行細胞計數；臺盼藍拒染法進行活率測定，應不低于90%。

無菌檢測：按梅里埃Bact/Alert 3D 120型全自動血培養(yǎng)無菌檢測系統(tǒng)進行檢測，上機培養(yǎng)7天，結果應為陰性。

計算細胞活率：細胞存活率計算采用計數300個細胞，其中活細胞所占的比率。每組重復5次，取平均值和標準差。以方差分析進行組間數據平均值統(tǒng)計，兩兩比較采用q檢驗。其中P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01表示差異有極顯著性。

3 實驗數據結果對比

3.1 性狀、無菌檢測結果

兩種保存溫度下，不同保存時間的3批次制劑性狀均無明顯變化為合格，無菌檢測結果均為陰性。

3.2 細胞活率檢測結果

在室溫條件下，3批樣品0～6 h細胞活率降低緩慢，活率均在90%以上。而6 h之后細胞活率降低較快且低于90%，為不合格。

在4℃條件下保存24 h，細胞存活率可維持在90%以上，隨保存時間延長而逐漸降低。保存前后物理檢查及無菌檢測結果穩(wěn)定，均無異常。結果詳見表1。

4 結論

3批樣品在室溫條件下保存24 h，性狀、無菌指標均無明顯變化。0～6 h細胞活率降低緩慢，且活率均在90%以上。而6 h之后細胞活率降低較快且不合格。而在4 ℃保存24 h存活率可維持在90%以上，隨保存時間延長而逐漸降低。保存前后物理檢查及無菌檢測結果穩(wěn)定，均無異常。因此，可定臍帶間充質干細胞注射液保質期為24 h，保存溫度為4 ℃。

表1 細胞活率檢測結果

[1]Subbanna PK. Mesenchymal Stem Cells for Treating GVHD: in-vivo fate and Optimal Dose[J]. Med Hypotheses, 2007.69(2):469-670.

[2]Tyndall A, FA Houssiau. Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Autoimmune Diseases[J]. Ann Rheum Dis,2010,69(8):1413-1414.