夏昕 阮毅 陳絳媛 孔祥波 伍虹

【摘要】 目的? ?研究C57小鼠不同發(fā)育時期頜骨中DMP1基因附近長鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達變化情況。 方法? ?利用lncRNA測序技術(shù)和實時定量PCR（RT?PCR）檢測孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下頜骨組織樣本中DMP1基因位置附近的lncRNA表達變化，分析其與DMP1基因表達變化的關(guān)系。 結(jié)果? ?E18D組與2W組間有6 617條差異表達的lncRNA（∣log2 （2W/E18D）∣>1且控制錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.01），其中有5條lncRNA在DMP1基因上游或下游300 000 bp以內(nèi)。RT?PCR分析顯示，2W組中DMP1和lnc19450的表達較E18D組降低，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達較E18D組上升（P均<0.05）。結(jié)論? ?lnc19450的表達與DMP1基因的表達趨勢一致，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達與DMP1基因的表達趨勢相反，推測lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表達調(diào)控起著重要的作用。

【關(guān)鍵詞】? 長鏈非編碼核糖核酸;牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因;小鼠頜骨發(fā)育

【Abstract】 Objective? ?To analyze the changes in the expression of long non?coding RNA （1ncRNA） adjacent to the DMP1 gene in different developmental stages of jawbone in C57 mice. Methods? ?The lncRNA sequencing and quantitative real?time PCR （RT?PCR） were performed to detect the expression profile of DMP1 gene?related lncRNAs at the embryonic day 18 （E18D） and 2 weeks after birth （2W） in the jawbone of C57 mice，and analyze the relationship between lncRNA expression and the changes in the expression of DMP1. Results? ?Compared with the E18D group，6 617 lncRNAs were differentially expressed in the 2W group （∣log2 （2W/E18D）∣>1 and FDR<0.01），among which，5 lncRNAs were at the upstream or downstream of DMP1 gene position within 300 kb. RT?PCRdemonstrated that the expression levels of DMP1 and lnc19450 in the 2W group were lower than those in the E18D group，whereas the expression levels of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 were higher compared with those in the E18D group （all P<0.05）. Conclusions? ?The expression trends of lnc19450 and DMP1 are consistent，whereas the expression patterns of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 are opposite with that of DMP1 gene，suggesting that lnc19450，lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 may play a vital role in regulating the expression of DMP1 gene.

【Key words】 Long non?coding RNA;DMP1 gene;Mouse jawbone development

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，不編碼蛋白，在生物體重要生命活動中發(fā)揮著極廣泛的調(diào)控作用[1?3]。lncRNA 的功能多樣，最重要的作用是參與基因表達的調(diào)節(jié)。目前研究表明，lncRNA可以在啟動子區(qū)通過順式作用元件（啟動子或增強子）或反式作用因子（各種DNA結(jié)合因子）調(diào)控相關(guān)基因的表達[4?5]。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）是骨和牙本質(zhì)特異性蛋白，在牙和頜骨的分化、成熟過程以及正確調(diào)節(jié)骨和牙本質(zhì)的礦化中具有復(fù)雜而重要的作用[6?7]。DMP1基因的正常表達是骨和牙齒正常發(fā)育、鈣化、干細胞向骨和牙本質(zhì)分化以及正常的礦物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)[8?9]。因此，研究DMP1基因表達調(diào)控的變化具有重要意義。本研究利用lncRNA測序技術(shù)和實時定量PCR（RT?PCR）檢測孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下頜骨組織樣本中DMP1基因位置附近的lncRNA的表達變化，并分析它們與DMP1基因表達的趨勢。

材料與方法

一、實驗動物

孕18 d以及出生后2周的C57小鼠，體質(zhì)量10～15 g，購自中山大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)（大學(xué)城）實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～22℃、12 h光照?黑暗循環(huán)，動物可自由取食及飲水。本研究的所有操作均遵守中山大學(xué)動物實驗倫理規(guī)定。

二、主要試劑及儀器

Trizol提取液和RT?PCR試劑盒均購自日本Takara公司;引物由上海生工合成;Nanodrop2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司;RT?PCR儀（ABI Stepone Plus）購自美國Applied Biosystems公司;lncRNA?seq高通量基因測序儀（Illumina HiSeqTM2000）購自美國Illumina公司。

三、方 法

1. 取 材

取2只日齡為14 d的雄性C57小鼠與6只日齡為16 d的雌性C57小鼠分別合籠（雄∶雌=1∶3），次日通過觀察雌鼠陰道栓情況確定是否受孕，受孕小鼠定義為孕1 d，以此精確記錄懷孕時間獲得E18D C57小鼠。對E18D（3只）以及2W（4只）小鼠逐只稱重，按體質(zhì)量0.01 ml/g腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，麻醉后的小鼠固定于干冰解剖臺上，于顯微鏡下解剖分離完整下頜骨組織，液氮速凍，保存于?80 ℃冰箱。取材完成后，采用頸部脫臼法處死小鼠，按實驗動物死亡處理方式處理，麻醉及后續(xù)處理方法參考文獻[10]。

2. 總RNA抽提

取適量（50～100 mg）小鼠下頜骨組織樣本，用研缽在液氮環(huán)境下研磨，按照試劑盒說明書步驟，分別抽提E18D及2W小鼠的下頜骨組織總RNA。對提取得到的RNA通過Nanodrop2000測定光密度值以及瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，檢測合格后，其中一部分送基迪奧生物進行l(wèi)ncRNA?Seq高通量基因測序分析，剩余部分用于后續(xù)的RT?PCR驗證分析。

3. lncRNA測序數(shù)據(jù)分析

采用Illumina HiSeqTM 2000進行測序，對下機數(shù)據(jù)去除掉質(zhì)量不合格的堿基序列及核糖體RNA，將得到的非編碼序列與Ensemble基因組數(shù)據(jù)庫進行比對。測序結(jié)果的統(tǒng)計分析基于泊松分布模型，根據(jù)lncRNA的表達量（RPKM值）計算該lncRNA在E18D組和2W組中的差異表達倍數(shù)[log2 （2W/E18D）]，對差異檢驗的P值作多重假設(shè)檢驗校正，通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）決定P值的域值，其中∣log2 （2W/E18D）∣>1且FDR<0.01的lncRNA為差異表達的lncRNA。

4. RT?PCR

對E18D組和2W組樣本中的DMP1基因以及在DMP1基因附近（300 000 bp以內(nèi)）差異表達的lncRNA進行RT?PCR分析。取2 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit步驟完成逆轉(zhuǎn)錄，取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用SYBR Green qPCR SuperMix反應(yīng)體系，在ABI Stepone Plus系統(tǒng)上進行RT?PCR擴增，引物序列見表1。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40 個循環(huán)。 PCR產(chǎn)物的特異性根據(jù)熔解曲線判定，融解曲線分析溫度60 ～ 95 ℃?；虻南鄬Ρ磉_量采用2?ΔΔCt法分析，內(nèi)參基因為GAPDH，E18D組的目標基因表達設(shè)置為1。每個樣品均平行做3個復(fù)孔。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。E18D組與2W組的基因相對表達量以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、E18D組和2W組中差異表達lncRNA的分析

通過lncRNA測序技術(shù)在E18D組和2W組中共鑒定到38 566條lncRNA，其中6 617條在E18D組和2W組樣本中差異表達，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720條，RPKME18D

二、DMP1基因附近差異表達lncRNA的分析

對6 617條小鼠頜骨不同發(fā)育時期差異表達的lncRNA在基因組的位置以及其相對DMP1基因（5號染色體，104202613?104214102，Ensemble數(shù)據(jù)庫編號為ENSMOSG00000029370）的距離進行分析，在DMP1基因附近獲得5條差異表達的lncRNA，見表2。其中l(wèi)nc30219和lnc17290在DMP1基因的上游，而lnc19450、lnc8282和lnc32865在DMP1基因的下游，lnc19450距離DMP1基因最近，為16 505 bp。

三、E18D組和2W組中DMP1及其基因附近5條lncRNA的RT?PCR分析

DMP1基因在2W組相對表達水平低于E18D組（P<0.05）。E18D與2W組間差異表達且位于DMP1基因附近的5條lncRNA中，lnc19450在2W組中相對E18D組的表達水平下降，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865在2W組中相對E18D組的表達水平上升（P均<0.05），其中l(wèi)nc32865相對表達水平最高，見圖1、表3。

討論

lncRNA在生物體重要生命活動中發(fā)揮極廣泛的調(diào)控作用[9]。大多數(shù)的lncRNA在組織分化發(fā)育過程中，具有明顯的時空表達特異性、組織或細胞特異性[11]。目前對于在頜骨發(fā)育過程中起著重要作用的lncRNA未見報道，為了篩選出在小鼠頜骨不同發(fā)育時期差異表達的lncRNA，我們采用E18D和2W的C57小鼠下頜骨組織為研究材料，利用Illumina HiSeqTM2000平臺的lncRNA測序技術(shù)在E18D組和2W組樣本中，共檢測出38 566條lncRNA。通過差異表達倍數(shù)（2倍及以上）和多重假設(shè)檢驗校正（FDR<0.01）分析，共獲得6 617條在E18D組和2W組樣本中差異表達的lncRNA，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720條，RPKME18D

lncRNA 可以通過多種方式調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，如通過表觀遺傳修飾途徑包括組蛋白修飾（乙?；?、甲基化等）方式或DNA甲基化等調(diào)控基因的表達水平[12?13]。lncRNA 也可以作用于啟動子、轉(zhuǎn)錄因子，抑制下游蛋白質(zhì)基因的表達;抑制目的基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄干擾等在基因轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控[14?16]。DMP1在牙和頜骨的分化、成熟過程以及正確調(diào)節(jié)骨和牙本質(zhì)的礦化中具有復(fù)雜而重要的作用，骨細胞中DMP1基因表達的時空特異性可能受非編碼區(qū)的順式調(diào)節(jié)區(qū)調(diào)控[17]。lncRNA具有時空表達特異性，并可以通過順式作用元件調(diào)節(jié)機制調(diào)控目的基因的表達。為了篩選出可能通過順式作用元件調(diào)節(jié)機制參與調(diào)控DMP1基因表達的lncRNA，本研究對6 617條lncRNA在基因組的位置以及其相對DMP1基因的距離進行初步分析，在距離DMP1基因300 000 bp以內(nèi)區(qū)域獲得5條差異表達lncRNA，分別為lnc19450、lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc?32865，其中l(wèi)nc19450距離DMP1基因最近。為了對lncRNA測序的結(jié)果進行驗證，本研究采用RT?PCR對DMP1基因以及5條lncRNA在E18D組和2W組樣本中的表達水平進行分析。在2W組中，DMP1基因的表達水平相比E18D組降低，這一結(jié)果也與已經(jīng)發(fā)表的文獻報道一致[18?20]。E18D組與2W組中5條lncRNA的表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與lncRNA測序結(jié)果一致。lnc19450的表達與DMP1基因的表達趨勢一致，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達在2W組中上升，與DMP1基因的表達趨勢相反，其中l(wèi)nc32865相對表達水平最高。由此推測，lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表達調(diào)控中起著重要的作用，其中距離DMP1基因較近的lnc19450和相對表達水平較高的lnc32865可能與DMP1的關(guān)系較為密切。上述研究結(jié)果為進一步闡明lncRNA調(diào)控DMP1基因表達的分子機制提供了基礎(chǔ)，在后續(xù)實驗中，我們將運用過表達或小干擾RNA沉默技術(shù)，闡明相應(yīng)lncRNA在過表達或抑制后DMP1的表達情況，探討lncRNA19450或lncRNA32865對DMP1的mRNA表達的調(diào)控作用以及成骨細胞礦化作用的影響，再通過RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、凝膠遷移實驗和啟動子雙熒光素實驗等分析手段，揭示lncRNA19450或lncRNA32865是否通過結(jié)合DMP1基因的啟動子區(qū)形成組蛋白修飾復(fù)合物的分子機制調(diào)控DMP1基因的表達，從而明確其在頜骨發(fā)育過程中的作用及相關(guān)作用機制。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2018?10?22）

（本文編輯：林燕薇）