李政宏 ，李 勇 ，鄒 凱，李忠健 ，趙蘭勇*，徐宗大 *

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東 泰安 271000；2.肥城市園林綠化管理局，山東 肥城 271600）

玫瑰是重要觀賞花木，不僅被廣泛用于城鄉(xiāng)綠化中，而且是食品工業(yè)和香料工業(yè)的重要原料[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對玫瑰的研究主要集中在花色、育種、品種分類和花期調(diào)控等方面，對玫瑰株型研究甚少。株型是園林植物的重要觀賞性狀[2]。植物的株型主要與地上部分枝角度有關(guān)，研究結(jié)果表明植物分枝和眾多因素有關(guān)，包括分子調(diào)控機制、重力響應(yīng)以及光周期等[3]。隨著基因組學(xué)研究的進一步發(fā)展，調(diào)控植物分枝角度的IGT基因家族被發(fā)現(xiàn)，該家族包含 LAZY1、TAC1、DRO1 等基因[4-7]。 其中 LAZY1 沉默可以造成植物側(cè)枝水平生長，削弱重力反應(yīng)，在玉米LAZY1突變體的研究中，突變體的根部向地性生長仍然正常，但地上部分卻完全匍匐生長，這說明LAZY1基因主要參與植物地上部分的分枝調(diào)節(jié)[8]。

以往設(shè)計簡并引物的方法都建立在大量生物信息收集的基礎(chǔ)上，通過比對同源性較高的氨基酸序列，找到它們共同的保守區(qū)域，再由它們的保守區(qū)域進行引物設(shè)計[9]。傳統(tǒng)方法需要花費大量時間去比對序列，不僅消耗很多的時間精力而且設(shè)計出來的引物往往都有著較高的簡并度。本研究通過CODEHOP在線程序設(shè)計簡并引物，以玫瑰幼莖cDNA作模板，經(jīng)過RT-PCR克隆得到玫瑰LAZY1基因片段，為后續(xù)玫瑰LAZY1基因擴增和研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玫瑰匍匐品種‘平枝玫’，種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)玫瑰種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 取材

2017年4 月中旬，植株長出嫩枝時，將其剪下,放入液氮，在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取

參照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書，完成玫瑰幼莖總RNA的提取。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈

參照abm公司5XAll-In-OneRTMasterMix試劑盒的使用說明書，合成cDNA，包括基因組DNA的去除。反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA放于-20℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)在水稻、玉米、楊樹、桃樹等植物中已有的關(guān)于LAZY1基因的序列信息，使用Genebank數(shù)據(jù)庫找到五條以上LAZY1同源基因，短柄草（XM_010239413.2）、高粱（XM_002449467.2）、谷子（XM_004979233.2）、胡楊（XM_011022498.1）、毛果楊（XM_002299287.2）、木薯（XM_021774420.1）、水稻（XM_015761205.1）、桃樹（XM_007223027.2）、玉米 （NM_001138862.1）。將以上序列保存為FASTA格式，提交到blockmaker，對序列保守區(qū)進行同源查找后，得到10個保守區(qū)。將10個保守區(qū)提交到CODEHOP服務(wù)器進行簡并引物設(shè)計，各項引物設(shè)計參數(shù)為：簡并度（degeneracy）64，Tm 值 60℃，遺傳密碼“Standard”，密碼子選用框選擇和玫瑰同屬薔薇科的蘋果（malus domestica）。參數(shù)選擇完畢點擊“Look for primers”,在新界面選擇分?jǐn)?shù)高的引物序列，將所選序列提交上海生物工程公司合成。

1.2.5 PCR擴增

PCR擴增LAZY1基因片段，以玫瑰幼莖RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用設(shè)計好的簡并引物進行RT-PCR擴增。本實驗采用降落PCR（touchdown PCR）程序[10-13]：94℃預(yù)變性 5min，之后進入擴增程序，94℃變性30s，62℃—50℃每降一度循環(huán) 2次，49℃循環(huán) 20次，72℃延伸 1min，共 44個循環(huán)，最后72℃延伸8min。擴增完后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

1.2.6 產(chǎn)物回收、測序

用Takara DNA回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物片段，與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1培養(yǎng)，之后進行菌液PCR驗證，驗證完成后將菌液送交華大基因測序。

1.2.7 PCR產(chǎn)物結(jié)果分析測序結(jié)果通過NCBI的數(shù)據(jù)庫進行Blast檢索，對產(chǎn)物片段進行序列比對和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡并引物設(shè)計

從CODEHOP程序設(shè)計得到多對引物中，篩選出6條上游引物和4條下游引物 （表1）。再通過oligo分析，根據(jù)退火溫度相差小，簡并度小，所得產(chǎn)物片段不要太小的原則，從中選出上游引物UP1、UP3、UP6，下游引物 DW2、DW4 進行配對，組成引物組合表（表2）

2.2 RT-PCR電泳結(jié)果

由表2的引物組合進行RT-PCR，經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測后，結(jié)果B組和D組引物未擴增出條帶，A、C和E組引物擴增結(jié)果中不止一條帶，說明引物對特異性不強，F(xiàn)對引物擴增出一條帶，說明F對引

表1 引物篩選結(jié)果

表2 引物組合表

物特異性較好（圖1）。

圖1 PCR擴增結(jié)果

2.3 PCR產(chǎn)物回收和序列分析

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，實驗選取F組引物克隆片段進行回收，經(jīng)過載體克隆測序后，得到長度為410bp的片段，將其命名為F片段。測序后的片段在Genbank中通過Blast進行比對（表3），其中 Blastn結(jié)果表明F片段與歐洲甜櫻桃 （Prunus avium）的LAZY1基因序列同源性為85%，得分為490，E value為2e-134，這說明F片段和歐洲甜櫻桃的LAZY1基因序列同源性較高。Blastx的結(jié)果顯示F片段編碼氨基酸與葡萄 （Vitis vinifera）LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為64%，得分為156分；和Herrania umbratica中LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為61%，比對得分為143分；和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）中LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為68%，比對得分為132分；和麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）中LAZY1基因編碼的氨基酸同源性為66%，比對得分為127分。通過Blast的結(jié)果，可以說明克隆片段為玫瑰LAZY1基因片段。

3 討論

為了獲取未知核酸序列，需要進行大量生物信息的收集。張磊和馬月林在克隆目的基因時，根據(jù)和研究材料親緣關(guān)系近的物種同源基因直接設(shè)計引物，這種方法只能針對那些已有轉(zhuǎn)錄組或者基因組數(shù)據(jù)的近緣物種[3,14]。當(dāng)研究對象沒有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時，這種方法就不可行了。這時需要通過設(shè)計簡并引物，對研究對象進行同源克隆得到目的基因。

傳統(tǒng)的簡并引物設(shè)計建立在大量生物信息的收集上。首先大范圍搜索已知目的基因編碼的氨基酸序列，通過比對不同物種的氨基酸序列確定氨基酸保守區(qū)域，保守區(qū)域長度不能低于6個氨基酸殘基長，再根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計簡并引物。使用這種方法設(shè)計的簡并引物簡并度往往偏大，并且簡并引物的特異性也不高，PCR出現(xiàn)非特異性擴增的可能性很大。同時由于密碼子的簡并性，設(shè)計出來的簡并引物退火溫度（Tm值）容易偏低，造成PCR假陽性反應(yīng)，給后續(xù)研究增大人力和物力投入[15-18]。

相比于傳統(tǒng)簡并引物設(shè)計方法，利用CODEHOP設(shè)計簡并引物具有特異性高及靈敏性強等優(yōu)點。CODEHOP方法的原理是把簡并引物設(shè)計為兩個部分，第一部分是3’簡并核心區(qū)，先比對多個同源序列得到共同的氨基酸保守區(qū)域，再從氨基酸保守區(qū)域中選取既連續(xù)又保守的3~4個氨基酸序列進行引物設(shè)計，因為是從連續(xù)保守序列開始設(shè)計的引物，所以可以保證引物設(shè)計的成功率高；另一部分為5’非簡并夾板區(qū)，這一部分是由保守氨基酸對密碼子的偏愛性原則預(yù)測所得到的最佳堿基組成。在設(shè)計簡并引物的過程中，可以通過調(diào)整3’簡并核心區(qū)的長度來達(dá)到降低簡并堿基使用量的目的。依靠5’非簡并夾板區(qū)的保守性，可以使3’簡并核心區(qū)在擴增過程中與模板結(jié)合的更穩(wěn)定，并且5’非簡并夾板區(qū)也可以在不增加簡并度的同時提高引物的Tm值，這些都可以提高PCR產(chǎn)物擴增的特異性。當(dāng)然，在擴增開始時，5’非簡并夾板區(qū)可能會和模板發(fā)生錯配，但3’核心區(qū)與模板的不適配會終止引物對與模板的配對，經(jīng)過連續(xù)多輪擴增后引物的特異性匹配會大量增加，最終提高擴增的特異性和準(zhǔn)確性。對于克隆未知基因片段是一種高效而使用的方法。

表3 F片段Blast結(jié)果

本研究利用CODEHOP在線設(shè)計簡并引物，配合降落PCR（Touchdown PCR）技術(shù)，成功克隆出玫瑰LAZY1基因片段，為后續(xù)玫瑰LAZY1基因全長的克隆奠定基礎(chǔ)，也為IGT基因家族中各基因的起源和演化提供參考。

[1] 徐宗大,趙蘭勇,張玲.玫瑰SRAP遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜構(gòu)建 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,44(8):1662-1669.

[2] 張淑梅.地被菊匍匐生長特性形成機理研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[3] 張磊，葉志瑋.沙柳 SpsLAZY1a和 SpsLAZY1b 基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2017,32(1):98-105.

[4] Chris D,Ann C.PpeTAC1 promotes the horizontal growth of branches in peach trees and is a member of a functionally conserved gene family found in diverse plants species[J].The Plant Journal,2013,75:618–630.

[5] Jessica M,Guseman.DRO1 influences root system architecture in Arabidopsis and Prunus species [J].The Plant Journal,2017,89:1093-1105.

[6] Baisheng Yu,Zhongwei Lin,Haixia Li,et al.TAC1,a major quantitative trait locus controlling tiller angle in rice[J].The Plant Journal,2007,52:891-898.

[7] Takeshi Y,Edgar P.AtLAZY1 is a signaling component required for gravitropism of the Arabidopsis thaliana inflorescence[J].The Plant Journal,2013,74:267-279.

[8] 姜川.玉米負(fù)重力性生長相關(guān)基因LAZY1的克隆及功能分析[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] 王少峽,陳麗媛,張競秋.利用生物信息學(xué)資源設(shè)計簡并引物[J].天津師范大學(xué)學(xué)報，2006,26(2).

[10] 李玉恒,趙明慧,趙紫陽.利用梯度PCR和降落PCR擴增CIRP基因的比較 [J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2011，23(5)：46-49.

[11] 萬兵,閆杰.一種優(yōu)化的PCR方法—降落PCR擴增目的基因[J].江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2002,6(2).

[12] 田路明,黃叢林.降落PCR法快速檢測高羊茅轉(zhuǎn)基因植株[J].生物技術(shù)通報，2006,3，023.

[13] 張瑞強,繁萍.利用降落 PCR 擴增 KMT-1 基因[J].青海大學(xué)學(xué)報，2010，28(2).

[14] 馬月林.沙柳TAC1基因克隆與生物信息學(xué)及組織表達(dá)特性分析[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[15] 佘朝文,蔣向輝.CODEHOP在線簡并引物設(shè)計與杉木4CL基因片段克隆[J].湖南臨沂科技，2009,36(6)..

[16] 夏志強,陳新,王海燕.簡并引物設(shè)計與大戟科3中植物WAX基因片段的克隆 [J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，23.034.

[17] 李運合,孫光明.利用CODEHOP和iCODEHOP設(shè)計簡并引物克隆芒果LAX基因家族片段 [J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(12)：2278-2282.

[18] 齊育平,周月婷.利用CODEHOP設(shè)計簡并引物克隆紅色紅曲霉絲氨酸羧肽酶基因片段和序列分析[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報，2014,37(1).