樊海平 ，薛凌展 ，陳玉紅 ，羅華枰 ，張坤 ，陳斌

（1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)研究院，福建 福州 350002；3.福建天馬科技股份集團(tuán)有限公司，福建 福州350308）

大刺鰍Mastacembelue armatus肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展前景。二十世紀(jì)八十年代以來，由于過度捕撈、產(chǎn)卵場(chǎng)和棲息地被破壞導(dǎo)致野生資源量逐年下降，自然種群衰退嚴(yán)重，福建、廣東、貴州等省已將大刺鰍列入省級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生水生動(dòng)物名錄。因此，開展大刺鰍人工養(yǎng)殖技術(shù)研究對(duì)種質(zhì)資源保護(hù)與利用具有重要意義。目前對(duì)大刺鰍的研究主要集中在胚胎發(fā)育[1]、營(yíng)養(yǎng)與消化[2,3]、地理種群結(jié)構(gòu)差異及資源保護(hù)[4,5]等，而大刺鰍對(duì)氨氮和亞硝酸鹽的耐受性研究未見報(bào)道。

水中氨氮源于魚類排泄物、殘餌和部分水生動(dòng)物殘骸等，主要以離子氨和非離子氨兩種形式存在，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的環(huán)境污染指標(biāo)之一。離子氨以水合形式存在，不能輕易穿越細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，毒性較弱，而非離子氨為脂溶性物質(zhì)，可穿越生物膜進(jìn)入機(jī)體，對(duì)水生動(dòng)物的毒性較強(qiáng)[6]。氨氮脅迫可使魚類鰓絲組織增生，粘液細(xì)胞增厚，血液攜氧能力下降[7]，肝臟組織水腫，抗氧化能力下降[8]等，影響生長(zhǎng)和存活。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮轉(zhuǎn)化成硝酸鹽的中間產(chǎn)物，一旦硝化作用受阻，亞硝酸鹽就會(huì)在水體中大量積累[9]，威脅魚類生長(zhǎng)，誘發(fā)一系列病變。在亞硝酸鹽脅迫下，魚類鰓細(xì)胞水腫，血管膨大，紅細(xì)胞皺縮破裂，肝胰臟發(fā)生病變，解毒功能受損[10,11]。

本文依照水生生物毒性方法研究氨氮和亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的急性毒性，以期為控制養(yǎng)殖水質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用大刺鰍來自順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司人工培育的當(dāng)年幼魚，平均體質(zhì)量（1.39±0.60）g，全長(zhǎng)（7.61±1.14）cm，暫養(yǎng)于直徑 1.0m的玻璃鋼桶中。3d暫養(yǎng)期間，每天早上9:00投喂2%～3%的由鰻鱺粉狀飼料制成的團(tuán)狀飼料，早晚各換水1次，每次換水30%左右，溶解氧為5.0～6.0mg/L，水溫 27.0～28.0℃，pH8.0～8.2。選擇體表完好、無寄生蟲及其他疾病、活力強(qiáng)的幼魚停食24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。

用分析純NH4Cl和NaNO2按1∶1000配置儲(chǔ)備液，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)置濃度，按比例添加，每組（10L）所加儲(chǔ)備液不超過100 mL。

1.2 方法

于圓形塑料容器中加入10L曝氣的養(yǎng)殖用水和9尾魚，按不同濃度加入試劑。依照水生生物毒性方法[12],試驗(yàn)期間不充氣。正式試驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，得出大刺鰍幼魚24h絕對(duì)致死濃度和最大耐受濃度。根據(jù)此濃度范圍設(shè)置等對(duì)數(shù)間距濃度值。設(shè)8個(gè)亞硝酸鹽濃度：0（對(duì)照組）mg/L、0.49 mg/L、0.65 mg/L、0.75 mg/L、0.87 mg/L、1.15 mg/L、1.55mg/L 和2.10 mg/L；設(shè)9個(gè)氨氮濃度，總氨氮（非離子氨）依次是 0（對(duì)照組）mg/L、37（2.26）mg/L、42（2.56）mg/L、49（2.99）mg/L、56（3.42）mg/L、65（3.96）mg/L、75（4.57）mg/L、87（5.31）mg/L和 100（6.10）mg/L。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每隔12h更換試驗(yàn)液1次，對(duì)照組不加氨氮和亞硝酸鹽，但同樣每隔12h換水1次。試驗(yàn)期間溶解氧為 5.0～6.0mg/L，水溫 27.0～28.0℃，pH8.0～8.2。每天觀察魚的活動(dòng)情況，記錄24 h、48 h、96 h魚死亡數(shù)，及時(shí)清除，試驗(yàn)持續(xù)96 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行Probit回歸分析[13]，獲得半數(shù)致死劑量（LC50）。

安全劑量（SC）=96 h LC50×0.1，

式中96hLC50為試驗(yàn)動(dòng)物96h半數(shù)致死劑量。

非離子氨濃度=總氨氮濃度/[10(pKa-pH)+1]，

式中：pKa=0.09018+2729.92/T，

T 為開氏溫度，T=273+t，t為試驗(yàn)水溫[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對(duì)大刺鰍的急性毒性

氨氮對(duì)大刺鰍幼魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。試驗(yàn)中，對(duì)照組魚無死亡,隨著總氨氮濃度的上升和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)大刺鰍幼魚的毒性明顯增強(qiáng)，死亡魚數(shù)量明顯上升。87 mg/L（5.31mg/L）和100mg/L（6.10mg/L）組魚的24h死亡率高于50%；其中100 mg/L組的大刺鰍幼魚反應(yīng)激烈，全部死亡，其余6個(gè)組魚的死亡率均低于50%。氨氮24hLC50為78.35mg/L，非離子氨為4.78mg/L。當(dāng)氨氮脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至 48h 時(shí)，37（2.26）mg/L、42（2.56）mg/L、49（2.99）mg/L、56（3.42）mg/L、65（3.96）mg/L 和75（4.57）mg/L組魚的死亡率均低于50%。氨氮的48hLC50為77.15mg/L，非離子氨為4.71mg/L。氨氮脅迫試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（96h），37（2.26L）mg/L組未出現(xiàn)死亡，氨氮96hLC50為76.05mg/L，非離子氨為4.64mg/L。大刺鰍幼魚氨氮和非離子氨的安全濃度分別為7.61mg/L和0.46mg/L。

表1 大刺鰍幼魚的氨氮急性毒性結(jié)果Tab.1 The acute toxicity of ammonia nitrogen to spiny eel juveniles

表2 總氨氮和非離子氨對(duì)大刺鰍幼魚的半致死濃度和安全質(zhì)量濃度Tab.2 The median lethal concentration and safe concentration of total ammonia nitrogen and un-ionized ammonia to spiny eel juveniles

2.2 亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的急性毒性

亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表3。試驗(yàn)過程中，對(duì)照組魚無死亡,隨著亞硝酸鹽濃度的上升和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的毒性明顯增強(qiáng)，死亡魚數(shù)明顯上升。經(jīng)過24h脅迫后，1.15mg/L、1.55mg/L和 2.1mg/L組魚的死亡率超過50%，其余4個(gè)組的死亡率均低于50%，24hLC50為1.177mg/L。脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至48h時(shí)，0.49mg/L、0.65mg/L和0.75mg/L的死亡率仍低于50%，其余4組魚的死亡率高于50%，其中2.1mg/L組的魚全部死亡，48hLC50為0.921mg/L。當(dāng)亞硝酸鹽脅迫試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（96h），0.49mg/L、0.65mg/L和0.75mg/L組魚的死亡率分別為0%、28.57%和42.86%，仍低于50%，其余4組的死亡率高于50%，其中1.55mg/L和2.1mg/L2組魚全部死亡，96hLC50為0.798mg/L。大刺鰍幼魚亞硝酸鹽的安全濃度為0.0798 mg/L。

3 討論

3.1 大刺鰍幼魚氨氮和亞硝酸鹽急性中毒的行為癥狀不同

研究發(fā)現(xiàn)，大刺鰍幼魚在氨氮和亞硝酸鹽脅迫下的中毒癥狀不盡相同，這與其致毒機(jī)理密切相關(guān)。氨氮急性脅迫初期，大刺鰍幼魚躁動(dòng)不安，上躥下跳；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，幼魚逐漸喪失平衡能力，時(shí)而旋轉(zhuǎn)抽搐，時(shí)而側(cè)臥桶底，體色變深；最后死亡時(shí)頭部后仰，鰓蓋微張，體色發(fā)白。亞硝酸鹽脅迫初期，大刺鰍幼魚反應(yīng)激烈，狂游，沖撞；隨著脅迫時(shí)間的延遲，幼魚游泳能力減弱，側(cè)游，翻轉(zhuǎn)打旋，呼吸急促；最后痙攣麻痹，體色變深、側(cè)躺臥息死亡。

3.2 氨氮和亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的毒性差異較大

結(jié)果顯示，無論是總氨氮還是非離子氨，其3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的大刺鰍幼魚半致死濃度和安全濃度均顯著高于亞硝酸鹽組（表2、表3）。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，半致死濃度均有所變化，從24h到96h,總氨氮和非離子氨的半致死濃度分別降低了2.94%和2.93%，亞硝酸鹽組的半致死濃度降低了32.20%。亞硝酸鹽組魚的安全濃度僅為總氨氮和非離子氨的1.05%和17.35%，說明亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍的急性毒性強(qiáng)于氨氮。

3.3 氨氮和亞硝酸鹽對(duì)大刺鰍幼魚的毒性與其他魚類差異較大

本試驗(yàn)中，非離子氨對(duì)大刺鰍幼魚的安全濃度為0.46mg/L，遠(yuǎn)高于泥鰍Misgurnus anguillicaudatus的0.22mg/L[15]、黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco的0.15 mg/L[16]、歐洲鰻鱺 Anguilla Anguilla 0.219mg/L[17]、草魚 Ctenopharyngodon idellus 0.047mg/L[18]和鯉 Cypri－nus carpio Linnaeus 0.068mg/L[19]等，說明大刺鰍幼魚對(duì)非離子氨的耐受性要高于其他魚類。而大刺鰍幼苗對(duì)亞硝酸鹽的安全濃度僅為0.0823mg/L，遠(yuǎn)低于黃顙魚的 14.58mg/L[16]、歐洲鰻鱺 2.66mg/L[17]、鯉3.09mg/L、鰱 Hypophthalmichthys molitrix（Valenciennes,1844）2.04mg/L、鳙 Aristichthys nobilis1.99mg/L和草魚0.35mg/L[20]等，說明大刺鰍幼魚對(duì)亞硝酸鹽的毒性比其他魚類更敏感，這也是養(yǎng)殖生產(chǎn)中影響大刺鰍成活率的關(guān)鍵因素之一。所以，在大刺鰍集約化養(yǎng)殖過程中要注意監(jiān)控亞硝酸鹽的變化，提高池塘的溶解氧，減少殘餌和其他代謝產(chǎn)物的富集，避免出現(xiàn)亞硝酸鹽中毒等癥狀。

表3 大刺鰍亞硝酸鹽急性毒性結(jié)果Tab.3 The acute toxicity of nitrite to spiny eel juveniles

［1］薛凌展.大刺鰍胚胎發(fā)育觀察［J］.淡水漁業(yè),2014,44（2）:101-108.

［2］伍遠(yuǎn)安,梁志強(qiáng),李傳武,等.兩種刺鰍肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,32（5）:499-502.

［3］初慶柱,陳剛,張健東,等.大刺鰍消化系統(tǒng)的組織學(xué)研究［J］.淡水漁業(yè),2009,39（2）:14-18.

［4］何美峰,袁定清,崔利峰,等.汀江大刺鰍國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)魚類群落結(jié)構(gòu)及其影響因子［J］.上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2015,24（1）:121-129.

［5］楊華強(qiáng),李強(qiáng),舒琥,等.華南及鄰近地區(qū)大刺鰍遺傳多樣性的 ISSR 分析［J］.水生生物學(xué)報(bào),2016,40（1）:63-70.

［6］Ip Y K&ChewS F.Ammonia production,excretion,toxicity,and defense in fish:a review［J］.Fronttiers in Physiology,2010,134（1）:1-20.

［7］王昆.氨氮對(duì)鯉（Cyprinus carpio Linnaeus）幼魚部分組織及血液指標(biāo)的影響［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

［8］張武肖,孫盛明,戈賢平,等.急性氨氮脅迫及毒后恢復(fù)對(duì)團(tuán)頭魴幼魚鰓、肝和腎組織結(jié)構(gòu)的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2015,39（2）:233-244.

［9］Deane E E&WooN Y S.Impact ofnitrite exposure on endocrine,osmoregulatory and cytoprotective functions in the marine teleost Sparus sarba［J］.Aquatic Toxicology,2007,82（2）:85-93.

［10］劉海俠,孫海濤,劉曉強(qiáng),等.亞硝酸鹽中毒鯉的血液和組織病理學(xué)研究［J］.淡水漁業(yè),2010,40（3）:67-71.

［11］葉俊,肖琛,尹曉燕,等.亞硝態(tài)氮脅迫對(duì)草魚非特異性免疫性能的影響［J］.淡水漁化,2013,43（4）:40-44.

［12］周永欣,章宗涉.水生生物毒性試驗(yàn)方法［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社,1989:75-106.

［13］張力.SPSS在生物統(tǒng)計(jì)中的應(yīng)用［M］.廈門:廈門大學(xué)出版社,2008:152-155.

［14］Emerson K,Russo R C,Lund R E,et al.Aqueous ammonia equilibrium calculations:effect of pH and temperature［J］.Journal of the Fisheries Research Board of Canada,1975,32（12）:2379-2383.

［15］郝小鳳,劉洋,凌去非.氨氮對(duì)泥鰍的急性毒性及對(duì)其肝、鰓組織超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.水生態(tài)學(xué)雜志,2012,33（5）:101-107.

［16］李波,樊啟學(xué),張磊,等.不同溶氧水平下氨氮和亞硝酸鹽對(duì)黃顙魚的急性毒性研究［J］.淡水漁業(yè),2009,39（3）:31-35.

［17］潘小玲,陳百悅,樊海平,等.非離子態(tài)氨及亞硝酸鹽對(duì)歐洲鰻鱺的急性毒性試驗(yàn)［J］.水產(chǎn)科技情報(bào),1998,25（1）:20-23.

［18］梁健,王紅權(quán),金柏濤,等.氨氮對(duì)草魚幼魚的急性毒性試驗(yàn)［J］.科學(xué)養(yǎng)魚,2013（11）:50-51.

［19］劉漢友,徐麗麗.鯉魚氨態(tài)氮急性毒性試驗(yàn)［J］.河北漁業(yè),2012（1）:14-15.

［20］呂景才,沈成鋼,楊景華.亞硝酸鹽對(duì)幾種淡水魚苗的急性毒性試驗(yàn)［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,8（1）:65-68.