趙 旭，王文麗，李 娟

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070）

纖維素是綠色植物細(xì)胞壁的主要成分，是綠色植物通過光合作用形成的物質(zhì)，為地球上含量最大的碳水化合物［1］。然而由于纖維素降解速度緩慢，并且難溶于水，所以目前對纖維素的開發(fā)利用效率還非常低。我國纖維素類資源豐富，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中每年都產(chǎn)生數(shù)量非常巨大的作物秸稈和皮殼［2］，然而目前處理這些農(nóng)業(yè)廢棄物最主要的方法是將其在原地焚燒，這種方法雖然省時(shí)省力，但原地焚燒秸稈不僅沒有充分利用秸稈給農(nóng)民帶來應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)效益，而且還嚴(yán)重污染了環(huán)境，加速了環(huán)境的惡化［3］。理化降解纖維素的方法因降解成本高，容易污染環(huán)境而使用較少。無污染、綠色環(huán)保分解利用纖維素的有效途徑之一是利用纖維素酶的水解作用將其分解成小分子的有機(jī)物，并用這些有機(jī)物被用來合成多種為我們能利用的有益物質(zhì)。纖維素酶（Cellulase）是一類能夠降解纖維素生成葡萄糖等小分子有機(jī)物的酶的總稱，主要由真菌、放線菌、細(xì)菌等微生物產(chǎn)生，原生動物、軟體動物、昆蟲等在一定的條件下也可以產(chǎn)纖維素酶［4］。研究發(fā)現(xiàn)，真菌產(chǎn)生的纖維素酶活性較高，但其對纖維素的降解作用比較劇烈，會降低產(chǎn)品的質(zhì)量。與真菌相比，細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶對纖維素的降解要溫和的多，而且降解過程的可控性強(qiáng)，因此細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景［5-6］。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)是通過分析菌株對GenIII 微孔板上71種碳源的利用情況和23種化學(xué)物質(zhì)的敏感性來鑒定菌株的設(shè)備，GenIII 微孔板上的四唑類氧化還原染料顏色變化強(qiáng)弱代表微生物對碳源的利用程度和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度［7-8］。我們采用Biolog GEN III微孔板對從高溫蘑菇培養(yǎng)料中分離篩選出的1株纖維素降解菌細(xì)菌進(jìn)行了生理生化分析及鑒定，以期為高溫纖維素降解細(xì)菌的進(jìn)一步研究應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品取自甘肅省永昌縣新城子鎮(zhèn)的腐熟雙孢菇培養(yǎng)料。

1.2 試劑

供試試劑CMC-Na、剛果紅、蛋白胨、酵母膏均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 富集培養(yǎng)基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨1.0 g、 K2HPO42.0 g、（NH4）2SO41.0 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、定容至1 000 mL、121 ℃滅菌30 min。

1.3.2 篩選培養(yǎng)基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨 1.0 g、K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、 （NH4）2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 NaNO36.0 g、 瓊脂 15.0 g、 pH 7.0、 水 1 000 mL、121 ℃滅菌 30 min。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨1.0 g、K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、 （NH4）2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 NaNO36.0 g、 瓊脂 15.0 g、 pH 7.0、 水 1 000 mL、121 ℃滅菌 30 min。

1.4 菌株的分離純化

1.4.1 富集 稱取10 g樣品加入250 mL 的三角瓶中（裝有玻璃珠和90 mL富集培養(yǎng)基），在50 ℃、150 r/min搖床中每培養(yǎng)72 h傳代1次。傳代2次后涂布平板分離。

1.4.2 分離 采用梯度稀釋涂平板法。吸取富集培養(yǎng)液1 mL，接入9 mL生理鹽水中，獲得10-1的菌懸液，按以上方法依次稀釋得到10-2、10-3、10-4…10-8的菌懸液，選取梯度10-4～10-8的菌懸液，分別吸取100 μL涂布于纖維素培養(yǎng)基平板，50 ℃下培養(yǎng)72 h。通過平板涂布分離，共獲得15株50 ℃下可以在CMC平板上生長的菌株，分別命名為 X1～X15。

1.4.3 純化 待平板上長出菌落后，將平板培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落挑取并劃線接種到纖維素培養(yǎng)基上，50 ℃培養(yǎng)72 h。待長出菌落后，連續(xù)將單個(gè)菌落在纖維素平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3次，直到?jīng)]有雜菌為止。

1.5 菌株的培養(yǎng)和初篩

將初步分離純化到的所有菌株接種到纖維素平板培養(yǎng)基上，50 ℃下培養(yǎng)72 h。待長出菌落后，用質(zhì)量濃度為1 mg/L的剛果紅染色30 min，然后用1 mol/L的NaCl 溶液浸泡洗脫30 min，傾去洗液，觀察菌落有無透明圈，并測定透明圈直徑。CMC 酶相對活性［9］（A）計(jì)算公式如下：

A = 溶解圈直徑（cm）/ 菌體培養(yǎng)時(shí)間（d）。

1.6 菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定

CMC酶活力測定參照DNS 法［10］。 取2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC-Na 溶液（用0.05 mol/L pH 4.8 的檸檬酸緩沖液配制） 加入到10.0 mL的具塞試管中，然后加入0.5 mL 粗酶液并搖勻，60 ℃水浴30 min取出，加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，定容至10 mL。最后在540 nm波長下測定吸光值，以空白作為對照調(diào)零。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖的含量。酶活力單位定義為每mL酶液在1 min內(nèi)催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL。

1.7 菌株的Biolog鑒定

1.7.1 材料 Biolog GEN III微孔板（MicroPlate）、濁度儀、8通道電動移液器、BUG 瓊脂、O mniLog系統(tǒng)以及GN、GP數(shù)據(jù)庫。

1.7.2 方法 將篩選獲得的菌株在培養(yǎng)基（BUG+B）上33 ℃下培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽挑取少量菌落，將專用接種液制備為均一菌懸液，與標(biāo)準(zhǔn)菌懸液進(jìn)行濁度對比。首先調(diào)節(jié)菌懸液濃度至90%～98% T，然后將調(diào)好濃度的菌懸液移入到V型加樣槽中，再用8通道電動移液器將菌懸液按順序加入GEN III微孔板的所有孔中（每孔加入量為100 μL），最后將加好菌懸液的GEN III微孔板放入培養(yǎng)箱33 ℃培養(yǎng)。依次在培養(yǎng)4、8、12、16、24 h時(shí)用OmniLog讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù)，并通過與數(shù)據(jù)庫比較獲得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離及初篩

通過剛果紅對菌株進(jìn)行初篩的結(jié)果（圖1）可以看出，15株菌中共選出6株具有透明圈，且CMC酶相對活性較大的菌株，其中菌株X3的剛果紅染色透明圈最大，CMC 酶相對活性最高。

圖1 菌株CMC酶相對活性比較

2.2 選出菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）活性比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證初篩出菌株的產(chǎn)酶能力，對初篩選出的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活性結(jié)果（圖2）。 菌株 X3的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性最高，菌株X1的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性最低。菌株X3在50 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h后，粗酶液的羧甲基纖維素酶（CMCase）活力達(dá)20.36 U/mL。選出的6株纖維素菌中菌株X3和X11的酶活性較高，比菌株X2、X6、X8的CMCase高出60%以上；菌株X1的CMCase活性僅為2.97 U/mL。

圖2 菌株CMCase活性比較

2.3 菌株X3GEN III微孔板的鑒定及分析

菌株X3在GEN III 微孔板上的顯色變化（圖3）所示，菌株X3的陽性反應(yīng)為25個(gè)，陰性反應(yīng)為39個(gè)，處于“邊界值”的反應(yīng)為32個(gè)。碳源利用測試的陽性反應(yīng)有15個(gè)，陰性反應(yīng)有30個(gè)，說明菌株X3能利用D-蜜二糖等25種碳源?；瘜W(xué)敏感性測試的陽性反應(yīng)有10個(gè)，陰性反應(yīng)有9個(gè)。

圖3 X3在GEN III鑒定板上的反應(yīng)

2.4 選出菌株的Biolog鑒定

接有 X3菌懸液的 GenIII 微孔板 33 ℃培養(yǎng)16～24 h，經(jīng)Biology微生物鑒定系統(tǒng)鑒定得到的結(jié)果如表1所示。Biolog的菌株鑒定結(jié)果包括可能性（PROB）、 相似性（SIM）和位距（DIST）3 個(gè)參數(shù)，其中SIM值代表與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)菌株數(shù)據(jù)的相似度。如果SIM 值≥0.50，則認(rèn)為系統(tǒng)確定的種屬鑒定結(jié)果可信。SIM 值越接近1.00，可信度就越高。如果SIM值<0.50，而鑒定結(jié)果中所有屬名相同的SIM值之和又大于0.5，則可將結(jié)果認(rèn)定為鑒定菌株的屬名［11-12］。 菌株X3與芽孢桿菌（Bacillus vallismortis /subtilis） 相似度值為0.660，大于臨界值0.50，遺傳距離為4.875≤5.00，所以鑒定結(jié)果為芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）。芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）是細(xì)菌中的一個(gè)科，能形成芽孢（內(nèi)生孢子），對外界有害因子的抵抗力很強(qiáng)，廣泛分布于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。目前，研究芽孢桿菌產(chǎn)高溫纖維素酶及應(yīng)用的報(bào)道較少。

表1 菌株X3Biolog鑒定結(jié)果

3 結(jié)論討論

本研究利用剛果紅透明圈鑒別法從蘑菇培養(yǎng)料中分離篩選出1株產(chǎn)纖維素的菌株X3。該菌株在培養(yǎng)基初始pH為7.0、培養(yǎng)溫度為50 ℃、接種量為2%、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)72 h，CMCase活力達(dá)到20.36 U/mL。利用Biolog鑒定系統(tǒng)將菌株X3初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）。

產(chǎn)纖維素酶的微生物種類繁多。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對產(chǎn)纖維素酶微生物進(jìn)行了大量的分離篩選工作，形成了完善可靠的分離篩選方法［13］。目前較為常用的主要有剛果紅透明圈鑒別法和濾紙條崩潰法兩種［14］。有學(xué)者從溫泉水和堆肥中分離篩選出嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）［15-16］， 該菌產(chǎn)生的纖維素酶活最適溫度高于60 ℃，并且熱穩(wěn)定性很好。芽孢桿菌是一類可以在惡劣生長環(huán)境中生長的細(xì)菌，在生長環(huán)境惡劣它形成芽孢以抵抗惡劣環(huán)境對細(xì)胞的危害。芽孢桿菌可以在酸堿、高溫的環(huán)境中生存，從而放寬了芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)和儲存條件，有利于菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)和儲存［17］。雖然Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)常被用于鑒定純培養(yǎng)的革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌，但Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)具有局限性，就是它僅能對數(shù)據(jù)庫內(nèi)已有的菌種進(jìn)行鑒定，而數(shù)據(jù)庫以外的菌種就得不到鑒定結(jié)果［18-19］。影響B(tài)iolog 微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果的因素很多，如微生物培養(yǎng)液的純度、數(shù)量、活性、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等都會影響鑒定結(jié)果。16S rDNA鑒定方法是在屬水平上對細(xì)菌進(jìn)行鑒定的方法，如果要將細(xì)菌鑒定到種，還需要借助生理生化的方法。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)不僅可以將菌株鑒定到種水平，而且減化了操作步驟，節(jié)省了工作時(shí)間［20］。相信隨著Biolog微生物鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的不斷補(bǔ)充和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，其鑒定結(jié)果也將會更加準(zhǔn)確，將在微生物的鑒定工作中發(fā)揮非常重要的作用。

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