周 璇, 李玉明, 叢 聰, 王倩倩, 江 恒, 岳龍凱,堯水紅**

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外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝活性的影響*

周 璇1, 李玉明2, 叢 聰1, 王倩倩1, 江 恒3, 岳龍凱1,堯水紅1**

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 北京 100081; 2.黑龍江北大荒農(nóng)業(yè)股份有限公司291分公司農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 雙鴨山 155923; 3. 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 哈爾濱 150081)

本文采用飼料類芽孢桿菌(,P)、深紅紫鏈霉菌(,S)和黃綠木霉(, T), 組合構(gòu)建了3種單菌劑(P、S和T)、3種兩菌種復(fù)合菌劑(PT、PS和ST)及1種3菌種復(fù)合菌劑(PST), 并將之添加到紅壤中, 監(jiān)測(cè)各菌劑添加后土壤總磷脂脂肪酸(PLFAs)量、特征微生物PLFAs百分含量、土壤呼吸速率及總代謝熵的變化, 旨在探明外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝活性的影響, 進(jìn)而為優(yōu)化有機(jī)物分解菌劑種群配置提供參考。結(jié)果顯示, 添加單菌劑的P、S和T處理及添加兩菌種復(fù)合菌劑的PT和PS處理, 土壤微生物生物量顯著增加, 增幅17.2%~121.6%(<0.05)。添加外源腐解微生物后, 各處理的土壤微生物群落的細(xì)菌百分含量基本穩(wěn)定在79.6%~83.1%, 真菌百分含量顯著增加8.8%~50.6%; 而放線菌百分含量除P和ST處理外, 其他處理顯著降低9.4%~69.8%。PLFAs數(shù)據(jù)的主成分分析表明, 各外源菌劑處理與CK處理間的群落結(jié)構(gòu)變異由小到大依次為: 接種單菌劑的P、S和T處理, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的PT、PS和ST處理, 接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理。添加單菌劑的P、T處理以及添加兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理, 在短期內(nèi)影響了土壤微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng), 使土壤呼吸速率的峰值分別提高48.7%、53.7%和78.7%; 且外源腐解微生物組合的物種數(shù)量越多, 土壤微生物進(jìn)入潛伏期所需的時(shí)間越長(zhǎng)。從外源腐解微生物對(duì)土壤肥力的長(zhǎng)期影響來看, 兩菌種復(fù)合菌劑ST的添加使土壤微生物代謝活性提高28.9%,因此該處理的土壤碳礦化量增加11.1%; 添加單菌劑的S處理使土壤微生物代謝活性顯著降低32.4%, 因此該處理的土壤碳礦化量?jī)H降低7.3%; 而添加兩菌種復(fù)合菌劑的PS處理和3菌種復(fù)合菌劑的PST處理, 在保持代謝活性不變的情況下, 其土壤碳礦化量也降低5.8%~8.7%, 其原因有待進(jìn)一步研究。綜上所述, 外源腐解微生物的添加會(huì)改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及其生長(zhǎng)軌跡, 且隨外源腐解微生物組合的物種數(shù)量增多這一干擾程度越大, 而土壤微生物代謝活性與外源腐解微生物組合的物種數(shù)量無顯著相關(guān)性。

土壤微生物; 外源腐解微生物; 物種組合; 微生物生物量; 微生物群落結(jié)構(gòu); 微生物代謝活性; 土壤呼吸速率

有機(jī)物分解是土壤肥力形成的重要過程, 在土壤生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)中起樞紐作用。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的分解者, 也是最為活躍的部分。新鮮有機(jī)物輸入土壤后, 在微生物的作用下逐級(jí)分解, 最后以CO2形式釋放到大氣中[1-2]。因此, 有機(jī)物分解是一個(gè)持續(xù)而漫長(zhǎng)的過程, 同時(shí)也是一個(gè)微生物接力的過程, 國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者曾對(duì)此進(jìn)行過研究。有機(jī)物分解初期, 易分解的小分子有機(jī)物(蛋白質(zhì)、水溶性物)首先被發(fā)酵性腐解微生物利用[3-4]; 隨著易分解有機(jī)物的減少, 能分解大分子有機(jī)物(纖維素和半纖維素等)的微生物迅速繁殖, 即該階段有機(jī)物分解主要依靠真菌群落[5-6]; 最后利用難降解有機(jī)物(木質(zhì)素)的微生物成為土壤微生物的優(yōu)勢(shì)種群[7-8]。

外源腐解微生物是來源于土壤、飼料或堆肥中的能產(chǎn)生降解纖維素酶、半纖維素酶或木質(zhì)素酶等粗纖維酶類的微生物[9-10]。已報(bào)道的對(duì)纖維素降解能力強(qiáng)的微生物多為木霉菌屬()和類芽孢桿菌屬()等的菌株[11-12], 而黃綠木霉()和飼料類芽孢桿菌()正是其中最具代表性的微生物[13-14]。近年來, 一些隸屬放線菌門的淺紫鏈霉菌()、微桿菌(sp.)和紅球菌(sp.)等微生物也被發(fā)現(xiàn)能有效降解木質(zhì)素和纖維素類物質(zhì)[15]。隨著對(duì)外源腐解微生物的認(rèn)識(shí)逐漸加深, 其作為堆肥腐熟劑和秸稈還田腐解劑等備受重視。石其偉等[16]研究表明, 添加微生物菌劑促進(jìn)了稻草前期的分解作用和后期的腐殖化作用; 王曉娟等[17]研究表明, 添加腐解菌劑能加快雞糞升溫, 延長(zhǎng)高溫期, 縮短到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間。這些研究均表明外源腐解微生物的添加能顯著加速有機(jī)物分解的進(jìn)程。此外, 肖艷萍[18]研究發(fā)現(xiàn), 復(fù)合菌系[鏈格孢霉菌()+短梗霉菌()+鏈霉菌(sp.)+厄氏菌(sp.)]的纖維素分解效率至少是單菌株的2.33倍, 且當(dāng)各菌株等比例混合時(shí), 其協(xié)同降解能力最佳; 冀頤之等[19]研究發(fā)現(xiàn): 芽孢桿菌復(fù)合菌劑較單一芽孢桿菌不僅能加快纖維素和木質(zhì)素的降解速率, 還能提高黃腐酸的產(chǎn)量。此類研究均證實(shí)了復(fù)合腐解菌系較任何單一菌種能提高降解纖維素與木質(zhì)素能力。近兩年來, 部分研究關(guān)注腐解微生物的物種差異對(duì)有機(jī)物腐殖化進(jìn)程的影響, 并指出不同微生物對(duì)腐殖化進(jìn)程的作用體現(xiàn)在不同培養(yǎng)階段對(duì)不同物質(zhì)和官能團(tuán)的利用上[20-21]。但是, 關(guān)于外源腐解微生物對(duì)有機(jī)物腐解的影響機(jī)制尚不明確。

土壤微生物在有機(jī)物的分解過程中起到了很重要的作用, 外源腐解微生物的添加會(huì)引起土壤微生物數(shù)量和多樣性的改變[22-23], 但以往都是選用單菌劑或者通過篩選構(gòu)建復(fù)合菌系來進(jìn)行研究, 復(fù)合腐解菌系往往由于存在菌株組成的種類多, 鑒定困難的缺陷, 因而關(guān)于外源腐解微生物如何通過物種組合來影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及活性的相關(guān)試驗(yàn)證據(jù)很少。本文通過源頭控制構(gòu)建物種數(shù)量不同的腐解微生物組合, 采用培養(yǎng)試驗(yàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)土壤微生物生物量與群落結(jié)構(gòu)的變化, 明確外源腐解菌劑的物種組合對(duì)土壤微生物代謝活性及分解功能的影響。該研究結(jié)果不僅能為優(yōu)化有機(jī)物分解菌劑種群配置提供參考, 還可為培肥地力和穩(wěn)定土壤生態(tài)系統(tǒng)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為旱地紅壤, 采自江西省鷹潭市余江縣鄧家埠原種場(chǎng)三分場(chǎng)(28°5′N, 116°5′E), 地上植被為原生草叢, 取樣深度為0~20 cm。根據(jù)美國(guó)土壤系統(tǒng)分類[24], 該土壤屬于黏壤老成土, 根據(jù)中國(guó)土壤系統(tǒng)分類為富鐵土[25]。土壤的母質(zhì)是第四紀(jì)紅黏土, 土壤有機(jī)質(zhì)含量5.2 g·kg-1, 速效磷19.3 mg·kg-1, 速效鉀237 mg·kg-1, 陽離子交換量10.2 cmol·kg-1。

供試微生物: 包括飼料類芽孢桿菌, 為桿菌科的一屬細(xì)菌; 深紅紫鏈霉菌(), 為鏈霉菌科的一屬放線菌; 黃綠木霉, 為叢梗孢科的一屬真菌。這3個(gè)菌種均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏管理中心提供, 是從土壤中分離的腐解微生物, 具有較強(qiáng)的有機(jī)物分解能力, 常用于配制商用秸稈腐解菌劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

菌株培養(yǎng): 飼料類芽孢桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基, 深紅紫鏈霉菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基, 黃綠木霉菌采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。首先, 將純化的菌株各自接種到已制備好的適宜菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中, 恒溫(25±3) ℃培養(yǎng)7 d; 然后, 將菌液離心(8 000 r·min-1, 15 min), 經(jīng)無菌水清洗數(shù)次后, 以無菌水稀釋成接近5×108cfu·mL-1菌懸液備用。

接種試驗(yàn): 試驗(yàn)在恒溫(25±1) ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行。首先, 將風(fēng)干過2 mm篩的土樣調(diào)節(jié)至最大田間持水量的70%, 黑暗培養(yǎng)10 d, 恢復(fù)其土壤微生物活性。隨后, 將備用的菌懸液按物種數(shù)量1、2、3自由組合并吸附于載體上(菌種組合見表1), 連同未接種的對(duì)照, 共設(shè)8個(gè)處理。菌劑載體為無菌草炭(總有機(jī)碳含量397 g·kg-1, 全氮11.9 g·kg-1, 碳氮比33.5),菌劑載體滅菌后按各處理的菌種組合要求接種菌體, 接種的有效活菌數(shù)為3.8×108CFU·g-1。然后, 將菌劑載體按8‰的質(zhì)量百分比(投入草炭的碳含量與秸稈全量還田的碳含量相當(dāng))均勻地混入恢復(fù)活性的土壤中, 并將混勻后的土樣均分18份(每份樣品量折合干土重為50 g), 以保障每個(gè)取樣時(shí)間均能取3個(gè)重復(fù)。最后, 將各處理的樣品逐一置于250 mL的白色塑料瓶中恒溫培養(yǎng)30 d。在培養(yǎng)的過程中, 定期稱重及時(shí)補(bǔ)水, 以保持土壤水分含量相對(duì)穩(wěn)定。

取樣時(shí)間: 在培養(yǎng)的過程中每天連續(xù)監(jiān)測(cè)土壤呼吸速率, 分析接種后土壤微生物的生長(zhǎng)軌跡及代謝量; 在培養(yǎng)的第1 d、2 d、4 d、9 d、18 d和30 d, 動(dòng)態(tài)取樣測(cè)定土壤微生物生物量碳, 以計(jì)算整個(gè)培養(yǎng)周期中各處理的微生物生物量均值, 并結(jié)合累積呼吸量, 分析接種后土壤微生物代謝活性的差異; 在培養(yǎng)結(jié)束的第30 d, 取樣測(cè)定土壤磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA), 分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

表1 試驗(yàn)處理及菌種組合方法

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 磷脂脂肪酸含量測(cè)定

采用改進(jìn)后的Blight-Dyer法進(jìn)行磷脂脂肪酸(PLFA)的提取[26-28], 運(yùn)用GC-MS(Gas Chromatograph- Mass Spectrometry)分析儀分離不同分子, 并結(jié)合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖(Bacterial Fatty Acid Standards)和美國(guó)商品化的MIDI系統(tǒng)(Microbial Identification System)識(shí)別與定量磷脂脂肪酸?？侾LFAs含量()的計(jì)算公式如下:

式中:A和MW分別為單個(gè)PLFA生物標(biāo)記物的特征峰值和相對(duì)分子質(zhì)量,IS為內(nèi)標(biāo)的濃度,IS為內(nèi)標(biāo)19:0的特征峰值, DW為土壤干重(g), MW為脂肪酸甲酯的分子量, 2為校正系數(shù), 1 000為nmol的轉(zhuǎn)化系數(shù),為該試驗(yàn)中總特征PLFAs個(gè)數(shù)[29]。

將PLFA譜圖中對(duì)提取的PLFA總量的貢獻(xiàn)值小于1%的PLFA剔除[30], 篩選得到49個(gè)PLFAs, 其中10:0、12:0、13:0、14:0、15:0 2OH、16:0、17:0、18:0、20:0代表普通細(xì)菌源微生物; 革蘭氏陽性細(xì)菌[Gram-positive bacteria, G(+) bacteria]包括: 11:0 iso、12:0 iso、13:0 iso、13:0 anteiso、14:0 iso、14:0 anteiso、15:0 iso、15:0 anteiso、16:0 iso、16:0 anteiso、17:0 iso、17:0 anteiso、18:0 iso、19:0 iso; 革蘭氏陰性細(xì)菌[Gram-negative bacteria, G(-) bacteria]包括i14:1、a15:1、i15:1、15:1 ω8c、i16:1、16:1 2OH、16:1 ω9c、16:1 ω5c、17:1 ω5c、a17:1、17:1 ω8c、cy17:0、i18:1、18:1 ω7c、19:1 ω6c、19:1 ω11c、cy19:0 ω8c、20:1 ω9c; 18:1 ω9c, 18:2 ω6, 9c和18:3 ω6, 9, 12c代表真菌源微生物; 10Me 16:0, 10Me 17:0, 10Me 18:0和10Me 19:0代表放線菌源微生物。

1.3.2 土壤呼吸速率測(cè)定

采用堿液靜態(tài)吸收法[31-32], 吸取5 mL 0.1 mol·L-1于10 mL特制吸收容量瓶中, 并將此瓶懸掛于250 mL的白色培養(yǎng)瓶中, 以吸收微生物呼吸釋放的CO2, 25 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h, 用0.1 mol·L-1HCl滴定剩余的NaOH, 以計(jì)算CO2釋放速率。

1.3.3 土壤微生物生物量碳的測(cè)定

采用氯仿熏蒸浸提法, 詳見Vance等[33]、林啟美等[34]。以0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提熏蒸和未熏蒸的土壤, 浸提液過濾后直接用TOC儀(Vario TOC select, Elementar, Germany)測(cè)定[35]。轉(zhuǎn)換系數(shù)取0.38。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2013軟件; 不同處理間的差異用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)值進(jìn)行分析比較; 通過主成分分析來研究接種不同物種組合微生物后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化, 統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0, 并使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物生物量以可提取的土壤總PLFAs含量表征。試驗(yàn)所用的紅壤土著微生物生物量為141 nmol·g-1。該紅壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成中: 普通細(xì)菌類PLFAs占27.0%, G(+)細(xì)菌類PLFAs占20.4%, G(-)細(xì)菌類PLFAs占35.4%, 真菌PLFAs占9.1%, 放線菌類PLFAs占8.1%(圖1)。草炭是外源微生物接種的常用載體, 含有較為豐富的有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì), 且疏松多孔, 因而利于微生物的生長(zhǎng)繁殖[36-38]。在未接種試驗(yàn)開始時(shí)(即0 d), 紅壤加無菌草炭處理的微生物生物量為154 nmol·g-1, 較紅壤本底值有一定程度上的增加; 但該處理的各類微生物的特征PLFAs所占百分含量與紅壤土著微生物群落間無顯著差異(圖1), 說明紅壤加無菌草炭并未影響微生物的群落組成。因此, 以紅壤加無菌草炭作為本試驗(yàn)的對(duì)照處理, 能有效地反映接種外源腐解微生物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

圖1 試驗(yàn)用紅壤及紅壤加草炭的微生物群落結(jié)構(gòu)組成

不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters demonstrate significant differences between red soil and red soil with sterile peat.

接種不同物種組合的外源微生物并培養(yǎng)30 d后,各處理微生物生物量呈現(xiàn)一定的差異(圖2A)。未接種的紅壤加草炭處理(對(duì)照, CK)的微生物生物量為91 nmol·g-1; 接種單菌劑的P、S和T處理的微生物生物量為107~199 nmol·g-1, 顯著高于未接種的CK處理(<0.05); 接種兩菌種復(fù)合菌劑的PS和PT處理的微生物生物量分別為164 nmol·g-1、201 nmol·g-1, 也顯著高于未接種的CK處理(<0.05); 而接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST和接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理微生物生物量分別為97 nmol·g-1和93 nmol·g-1, 與未接種的CK處理無顯著差異。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成用各類微生物特征PLFAs的百分含量表征。單因素方差分析顯示, 未接種的對(duì)照處理(CK)的3大類菌群(細(xì)菌、真菌和放線菌)在培養(yǎng)結(jié)束后與0 d時(shí)相比無顯著差異。培養(yǎng)30 d后, 未接種CK處理的微生物群落中細(xì)菌類微生物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 其中普通細(xì)菌類占22.4%、G(-)細(xì)菌類占30.6%、G(+)細(xì)菌類占29.5%(圖2B); 真菌和放線菌類PLFAs分別占9.2%和8.3%(圖2C和D)。接種不同物種組合的外源微生物后, 各處理微生物群落中細(xì)菌的總比例(79.6%~83.1%)較未接種CK處理無顯著差異, 但細(xì)菌的組成有一定的變化(圖2B)。與未接種的CK處理相比, 接種單菌劑的S處理, 普通細(xì)菌PLFAs百分含量顯著下降20.0%, 而G(-)細(xì)菌PLFAs百分含量顯著增加11.4%; 接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理, G(+)細(xì)菌PLFAs百分含量顯著下降41.4%, 而G(-)細(xì)菌PLFAs百分含量增加19.5%; 接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理, G(+)細(xì)菌PLFAs百分含量顯著下降17.9%(圖2B)。接種不同物種組合的外源微生物后, 各處理的微生物群落中真菌所占比例顯著高出未接種的CK處理的8.8%~50.6%(圖2C)。各處理的微生物群落中放線菌所占比例, 接種單菌劑的P處理與未接種的CK處理無顯著差異, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理顯著高于未接種CK處理, 而其他5種菌劑處理較未接種的CK處理顯著降低9.4%~69.8%(圖2D)。

不同處理下土壤微生物PLFAs數(shù)據(jù)的主成分分析進(jìn)一步表明: 外源腐解微生物對(duì)土著微生物的群落結(jié)構(gòu)有顯著影響, 各處理在PC1和PC2上與未接種的CK處理均無交集(圖3A)。此外, 微生物的群落結(jié)構(gòu)與外源腐解微生物組合中的物種數(shù)量也呈一定的相關(guān)性。接種單菌劑的P、S和T處理均位于X軸的上方, 與未接種的CK處理最為接近(圖3A); 而接種兩菌種復(fù)合菌劑的PT、PS和ST處理處在X軸下方的第4象限, 與未接種的CK處理的間距大于接種單菌劑的3個(gè)處理; 接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理則位于X軸下方的第3象限, 與未接種的CK處理的間距最遠(yuǎn)(圖3A)。從PLFAs在主成分上的因子載荷圖分析, 對(duì)PC1貢獻(xiàn)大的PLFAs(特征向量系數(shù)>0.5)有13種, 其中普通細(xì)菌類PLFAs有5種, G(+)細(xì)菌類PLFAs有4種, G(-)細(xì)菌類PLFAs有2種, 放線菌類PLFAs有1種, 真菌類PLFAs有1種。對(duì)PC2起主要作用的PLFAs(特征向量系數(shù)>0.5)有8種, 其中普通細(xì)菌類PLFAs有1種, G(+)細(xì)菌類PLFAs有2種, G(-)細(xì)菌類PLFAs有3種, 放線菌PLFAs有2種(圖3B)。

2.2 外源微生物的物種組合對(duì)土壤微生物活性的影響

土壤微生物活性即微生物代謝活力, 可以用多種方法測(cè)定[39-42]。CO2釋放速率作為測(cè)定土壤微生物活性最常用的方法之一, 盡管存在一定的局限性, 但一直被廣泛的應(yīng)用[43]。外源腐解菌劑接種后土壤呼吸速率的動(dòng)態(tài)變化, 反映了不同物種組合的外源腐解微生物對(duì)土著微生物的擾動(dòng)軌跡(圖4)。由圖4可見, 未接種的CK處理在培養(yǎng)的過程中呈一條典型的微生物生長(zhǎng)特征曲線, 即: a-b為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 微生物以恒定的幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng); b-c為穩(wěn)定期, 由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡, 微生物數(shù)保持較穩(wěn)定的個(gè)數(shù); c-d為衰亡期, 微生物生長(zhǎng)減慢, 死亡數(shù)目增多; d-e為潛伏期, 微生物恢復(fù)到自然活性狀態(tài)。

圖2 培養(yǎng)30d后接種不同菌種及組合的土壤微生物生物量及特征微生物種群百分含量

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

圖3 接種不同菌種及組合處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異的主成分分析

外源腐解微生物的添加影響土壤微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)(表2)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn): 除P處理在接種單一飼料類芽孢桿菌后有一個(gè)明顯的停滯期, 其他單菌劑和復(fù)合菌劑的處理均快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 土壤呼吸速率在培養(yǎng)1 d后出現(xiàn)峰值(圖4, 表2)。在出現(xiàn)峰值時(shí), 接種單菌劑的P、T處理和接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理, 土壤呼吸速率分別高出未接種的CK處理48.7%、53.7%和78.7%, 而其他4種菌劑處理的土壤呼吸速率與未接種的CK處理間無顯著差異。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后, 各處理均快速進(jìn)入衰亡期、最后進(jìn)入潛伏期(圖4, 表2), 接種單菌劑的3個(gè)處理均在培養(yǎng)6~7 d后進(jìn)入潛伏期; 而接種兩菌種復(fù)合菌劑的3個(gè)處理在培養(yǎng)10~12 d后進(jìn)入潛伏期; 接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理的波動(dòng)周期最長(zhǎng), 在培養(yǎng)16 d后進(jìn)入潛伏期。

圖4 培養(yǎng)過程中接種不同菌種及組合處理的土壤呼吸速率變化

a→b代表微生物生長(zhǎng)特征曲線的對(duì)數(shù)期; b→c代表穩(wěn)定期; c→d代表衰亡期; d→e代表潛伏期。a→b represents the logarithmic phase of microbial growth curve; b→c represents the stable phase of microbial growth curve; c→d represents the decline phase of microbial growth curve; d→e represents the latency phase of microbial growth curve.

表2 接種不同菌種及組合處理土壤微生物活性特征指數(shù)

不同小寫字母表示不同處理間的差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

外源腐解微生物的添加改變了土壤微生物的生長(zhǎng)軌跡, 間接造成了各處理下土壤累積呼吸量的差異(圖5A)。土壤累積呼吸量反映了外源腐解微生物的添加對(duì)土壤微生物活性的長(zhǎng)期影響。未接種的CK處理的土壤累積呼吸量為1 145 mg·kg-1, 接種單菌劑的P和T處理及接種兩菌種復(fù)合菌劑的PT處理, 土壤累積呼吸量與CK處理無顯著差異; 接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理, 土壤累積呼吸量較CK處理顯著增加了11.1%; 而接種單菌劑的S處理, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的PS處理和接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理, 土壤累積呼吸量較之略有降低。微生物總代謝熵由土壤累積呼吸量與微生物生物量均值的比率來表征, 各處理微生物總代謝熵(qCO2)也存在一定的差異(圖5B)。接種單菌劑的S處理的微生物總代謝熵顯著低于CK處理; 而接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理的總代謝熵較之增加了28.9%; 其他菌劑處理的微生物總代謝熵與CK處理間無顯著差異。

圖5 培養(yǎng)周期內(nèi)接種不同菌種及組合處理的土壤累積呼吸量(A)和微生物總呼吸熵(B)

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

3 討論

3.1 外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

外源腐解微生物的添加改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。本文研究發(fā)現(xiàn): 接種深紅紫鏈霉菌(放線菌)的S、PS、ST、PST處理與CK處理相比, G(+)細(xì)菌的百分含量顯著降低, 說明深紅紫鏈霉菌的添加抑制了G(+)細(xì)菌的生長(zhǎng), 這與前人的研究一致[44-45]。此外, 研究還發(fā)現(xiàn): 外源腐解微生物添加后, 土壤微生物群落中的真菌百分含量增加、放線菌百分含量除P處理和ST處理外, 顯著下降。

從本研究中PCA分析結(jié)果可知: 各外源菌劑處理與CK處理間均無交集, 且各處理與CK處理間的差異, 以接種單菌劑的3個(gè)處理最小, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的3個(gè)處理較大, 而接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理最大。這一結(jié)果表明, 外源微生物的添加會(huì)顯著改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu), 且外源腐解微生物對(duì)土壤微生物群落的擾動(dòng)作用隨其物種數(shù)量增多而加強(qiáng)。究其原因可能是外源腐解微生物進(jìn)入土壤后, 與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分與生態(tài)位[46], 從而引起土壤中整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

土壤微生物生物量能反映土壤質(zhì)量狀況, 是評(píng)價(jià)土壤微生物狀況隨環(huán)境變化的敏感指標(biāo)。本體土壤中的微生物生物量在一定的條件下是相對(duì)穩(wěn)定的, 而當(dāng)外源腐解微生物進(jìn)入后, 土壤微生物生物量將發(fā)生改變[47-49]。本研究顯示, 單一飼料類芽孢桿菌(細(xì)菌)、深紅紫鏈霉菌(放線菌)和黃綠木霉(真菌)添加, 增加了土壤微生物生物量。此外, 菌種間無顯著的拮抗作用的復(fù)合菌, 也能適應(yīng)紅壤土體的酸性環(huán)境并迅速繁殖, 土壤微生物生物量顯著增加, 如本研究中的PS處理(飼料類芽孢桿菌和深紅紫鏈霉菌復(fù)合菌)與PT處理(飼料類芽孢桿菌和黃綠木霉菌復(fù)合菌)。與此同時(shí), ST處理(深紅紫鏈霉菌和黃綠木霉菌復(fù)合菌)與PST處理(飼料類芽孢桿菌、深紅紫鏈霉菌和黃綠木霉菌復(fù)合菌), 土壤微生物生物量與對(duì)照(CK)間無顯著的差異, 但僅通過土壤微生物生物量還不足以證明菌株間的拮抗作用, 其原因可能是多菌混合后菌量增加所引起的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用, 也可能是菌株代謝產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物所引起的抑菌現(xiàn)象, 具體原因?qū)⑦M(jìn)一步探究。

3.2 外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物活性的影響

土壤呼吸的動(dòng)態(tài)特征在一定程度上可反映土壤微生物活性的變化[50]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 外源腐解微生物的添加刺激土壤微生物的生長(zhǎng), 使土壤微生物群落快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(圖4), 之前的研究也有過類似報(bào)道: 證實(shí)自生細(xì)菌接種土壤后會(huì)對(duì)農(nóng)田土壤產(chǎn)生短期影響[51]。此外, 菌種組合中微生物的物種數(shù)量越多, 土壤微生物進(jìn)入潛伏期所需的時(shí)間越長(zhǎng), 這可能是由于外源微生物組合中的物種數(shù)量越多, 與土著微生物在養(yǎng)分、水分及生存空間上的競(jìng)爭(zhēng)更激烈, 土著微生物抵抗干擾所需的周期更長(zhǎng)[52]。菌種組合中的物種數(shù)量與土壤累積呼吸量間無相關(guān)關(guān)系。

微生物總代謝熵(qCO2)可靈敏地反映土壤微生物的代謝活性[53], qCO2越高, 微生物利用相同能量形成的生物量小, 釋放的CO2多, 土壤微生物代謝活性越強(qiáng)[54], 反之亦然。本研究發(fā)現(xiàn), 接種單菌劑的S處理使qCO2顯著降低, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理使qCO2顯著增加, 而其他5種外源菌劑處理不改變土壤的qCO2, 這說明接種單一深紅紫鏈霉菌的S處理能提高土壤微生物對(duì)碳的利用率, 從而利于土壤質(zhì)量的改善。接種兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理較大程度地?cái)_動(dòng)了紅壤微生物群落, 需要微生物耗費(fèi)更多的能量來平衡外界的干擾[55]?？傮w上來說, 土壤微生物代謝活性與菌種組合中的物種數(shù)量間并無相關(guān)關(guān)系, 這除了土著微生物對(duì)外界干擾的抵抗外, 還可能與外源腐解菌種間的協(xié)同作用有關(guān), 其中原因需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

外源腐解微生物的添加影響土壤微生物生物量, 改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu), 且外源腐解微生物對(duì)土著微生物群落結(jié)構(gòu)的干擾程度隨菌種組合中的物種數(shù)量增多而加強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)添加單菌劑P、S和T處理及添加兩菌種復(fù)合菌劑的PT和PS處理較未接種的CK處理土壤微生物生物量顯著增加, 其他處理與未接種的CK處理無顯著差異。本研究中除ST處理外, 其余各處理均在一定程度增加真菌的百分含量, 降低放線菌的百分含量; 且由PCA分析結(jié)果可知, 各處理與CK處理間的差異, 以接種單菌劑的3個(gè)處理最小, 接種兩菌種復(fù)合菌劑的3個(gè)處理較大, 而接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理最大。

外源腐解微生物的添加短期內(nèi)影響土壤微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng), 且菌種組合中的物種數(shù)量改變了土壤微生物進(jìn)入潛伏期的時(shí)間, 但土壤微生物的總體代謝能力與菌種組合中的物種數(shù)量無關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn): 除P處理有一個(gè)明顯的停滯期, 其他單菌劑和復(fù)合菌劑的處理均快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期; 且在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后, 接種單菌劑的3個(gè)處理進(jìn)入潛伏期所需時(shí)間最短; 接種兩菌種復(fù)合菌劑的3個(gè)處理進(jìn)入潛伏期所需時(shí)間居中; 接種3菌種復(fù)合菌劑的PST處理進(jìn)入潛伏期所需時(shí)間最長(zhǎng)。此外本研究也發(fā)現(xiàn), 添加單菌劑的P、T處理以及添加兩菌種復(fù)合菌劑的ST處理, 土壤呼吸速率峰值顯著提高; 但土壤累積呼吸量除ST處理較CK處理顯著增加外, 其他處理低于或與CK處理無顯著差異。

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Effects of species-combined exogenous decomposing micro-organisms on soil microbial community structure and metabolic activity*

ZHOU Xuan1, LI Yuming2, CONG Cong1, WANG Qianqian1, JIANG Heng3,YUE Longkai1, YAO Shuihong1**

(1. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Center of Agricultural Technology Extension, No. 291 Branch of Heilongjiang Beidahuang Agriculture Company Ltd, Shuangyashan 155923, China; 3. Northeast Institute of Geography and Agro-ecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China)

An incubation experiment was conducted to study the effects of species combination of exogenous decomposing micro-organisms on soil microbial community structure and metabolic activity. The objective of the study was to lay the basis for the optimization of population configuration of decomposing microbial agents. In the study, three microbe species —(P),(S) and(T) — were selected. For the experiments, in addition to single P, S and T microbe strains, the microbes were merged to produce two species (PT, PS and ST) and three species (PST) combinations of decomposing microorganisms (forming a total of 7 microbial agents). These microbial agents were then added to red soil sampled from Jiangxi Province in South China. Moreover, a control treatment of red soil added with sterile peat was set to the experimental design. During the incubation period, temporal changes in soil respiration rate and microbial biomass carbon were monitored. Additionally, the changes in total PLFAs content and in the proportion of characteristic microbial population in different treatments after 30 days of incubation were determined. The PLFAs percentages of microbial communities showed the total microbial biomass and composition of soil microbial communities. The results showed that, except for ST and PST, most treatments showed that total microbial biomass increased from 17.2% to 121.6% (< 0.05). Compared with the control, the proportion of fungus in all the treatments increased by 8.8%–50.6% (< 0.05). However, the proportion of bacteria in PLFAs remained basically unchanged, increasing from 79.6% to 83.1%. For most of the treatments, except for P and ST, the proportion of actinomyces decreased from 9.4% to 69.8%. Principal component analysis (PCA) of PLFAs data indicated that soil microbial community structure was influenced by different decomposing micro-organisms agents. The change in microbial community structure varied with treatment type, among which single P, S and T microbe strains were smallest and their trio-combination (PST) biggest, compared with the control. The results of soil respiration rate showed the growth of micro-organisms. Treatments of single P and T microbe strains and binary combination of micro-organisms S and T (ST) affected logarithmic growth of soil microbes in the short-term, increasing peak soil respiration rate by 48.7% (P), 53.7% (T) and 78.7% (ST), respectively. Additionally, with increasing number of species of decomposing micro-organisms, it took more time for soil microbes to enter latent phase. From long-term impact of exogenous decomposing micro-organisms on soil fertility, these micro-organisms changed soil microbial metabolic activity, which led to a change in the amount of soil carbon mineralization. The addition of ST combination of microorganisms increased soil microbial metabolic quotient by 28.9%, consequently, the amount of soil carbon mineralization increased by 11.1%. The addition of single S microbe strain decreased soil microbial metabolic quotient by 32.4%, while the amount of soil carbon mineralization only decreased by 7.3%. However, under PS and PST combinations, microbial metabolic activity remained unchanged, while the amount of soil carbon mineralization decreased by 5.8% and 8.7%, separately. There was the need for further study on these treatment combinations. In conclusion, the addition of exogenous decomposing micro-organisms changed soil microbial community structure and growth trajectory. Furthermore, with increasing number of species of decomposing micro-organisms, change in microbial community structure increased. Finally, the study failed to account for any relationship between soil microbial metabolic activity and the number of species of decomposing micro-organisms.

Soil micro-organisms; Exogenous decomposing micro-organism; Species combination; Microbial biomass; Microbial community structure; Microbial metabolic activity; Soil respiration rate

, E-mail: yaoshuihong@caas.cn

Dec. 29, 2017;

Apr. 7, 2018

S154.36

A

1671-3990(2018)07-1056-11

10.13930/j.cnki.cjea.171216

* 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31400461)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所優(yōu)秀青年項(xiàng)目(634-6)資助

堯水紅, 主要研究方向?yàn)橥寥郎镂锢砼c微生物生態(tài)。E-mail: yaoshuihong@caas.cn 周璇, 研究方向?yàn)橥寥牢⑸锷鷳B(tài)。E-mail: xuanzhou15@163.com

2017-12-29

2018-04-07

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400461) and the Outstanding Youth Project of Agricultural Resources and Agricultural Regionalization Institute from Intellectual Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (634-6).

周璇, 李玉明, 叢聰, 王倩倩, 江恒, 岳龍凱, 堯水紅. 外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝活性的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 26(7): 1056-1066

ZHOU X, LI Y M, CONG C, WANG Q Q, JIANG H, YUE L K, YAO S H. Effects of species-combined exogenous decomposing micro-organisms on soil microbial community structure and metabolic activity[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(7): 1056-1066