蔣 桃，衛(wèi)朝輝，蒲 輝，張 檬，曾夢穎，張 迪，高 洪，嚴(yán)玉霖

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

皮膚作為機(jī)體最大的組織器官及第一道防線，具有重要的生理功能。外傷、燒傷、腫瘤切除手術(shù)等臨床上各種常見原因均能導(dǎo)致其損傷。其中促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)是治療皮膚損傷的重要環(huán)節(jié)，及時(shí)封閉創(chuàng)面可減少組織液滲出、預(yù)防細(xì)菌血流感染、防止膿毒血癥發(fā)生和減少發(fā)生器官并發(fā)癥，還可防治瘢痕的過度增生，降低對(duì)生命的威脅、減輕痛苦[1]。創(chuàng)傷修復(fù)也成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)，其一般分為三個(gè)相互重疊的階段，即炎性反應(yīng)期-增生期-重塑期[2-3]，每個(gè)階段都具有重要意義。因此，如何發(fā)現(xiàn)新的、有效的修復(fù)皮膚創(chuàng)面的治療方法是臨床研究的重要工作。隨著人們的生活水平的不斷提高提高，寵物犬飼養(yǎng)的數(shù)量也隨之增加。各種因素造成的犬皮膚損傷的病例約占臨床就診的10%～20%。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能夠有效地促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合[4-5]。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，其可以分化成多種功能細(xì)胞。具有再生各種組織器官的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。其分泌各種細(xì)胞因子，即干細(xì)胞分泌因子(stem cell-secreted factors，SCF)，具有刺激自體內(nèi)源性干細(xì)胞生長，誘導(dǎo)機(jī)體自身干細(xì)胞至受損部位進(jìn)行修復(fù)。干細(xì)胞分泌因子不僅具有與干細(xì)胞移植同樣的治療效果，而且可減少一些生物安全問題，同時(shí)，還具有更安全、更易操控的治療優(yōu)勢[6-7]。多種干細(xì)胞分泌因子還能助于調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，降低機(jī)體的炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)及抑制細(xì)菌生長[8-10]。對(duì)干細(xì)胞分泌因子的研究關(guān)注正逐漸的超過干細(xì)胞。國內(nèi)外對(duì)運(yùn)用干細(xì)胞分泌因子修復(fù)皮膚創(chuàng)面損傷的治療有許多的研究報(bào)道，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子治療修復(fù)皮膚創(chuàng)面的遠(yuǎn)期療效仍有待進(jìn)一步探究，本研究旨在探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子治療以犬為模型的皮膚創(chuàng)面的臨床效果。

本研究用干細(xì)胞組織修復(fù)因子治療以犬為模型的皮膚創(chuàng)面，與常規(guī)創(chuàng)面修復(fù)療法進(jìn)行比較，以期為骨髓干細(xì)胞分泌因子治療修復(fù)皮膚創(chuàng)面的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

4月齡已免疫健康中華田園犬幼犬9只，性別、體型不限。常規(guī)乳膏購于英國北愛爾蘭Botanica公司；注射用頭孢維星購于美國輝瑞發(fā)西亞-普強(qiáng)公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子分離與保存 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物病理教研室分離培養(yǎng)，經(jīng)純化鑒定后液氮保存。

1.2.2 動(dòng)物創(chuàng)面模型的制備 健康幼犬9只，術(shù)前30 min，注射長效抗菌素頭孢維星注射液(8 mg/kg)，經(jīng)腹腔注射試驗(yàn)動(dòng)物用舒泰50(7 mg/kg)麻醉，剪除局部被毛，在其背部從頭側(cè)向尾側(cè)分別切除3個(gè)30×30 mm全層皮膚。

1.2.3 分組 將皮膚創(chuàng)面損傷模型的9只幼犬，隨機(jī)分為3組，分別為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子(BMSCF)治療組、常規(guī)治療組(傷復(fù)康)和對(duì)照組。其中對(duì)照組術(shù)后不給藥，治療過程中發(fā)現(xiàn)創(chuàng)口有分泌物，每日用9 g/L氯化鈉注射液清洗創(chuàng)口2次。常規(guī)治療組在術(shù)后治療過程中發(fā)現(xiàn)創(chuàng)口有滲出物，在用藥前先用9 g/L氯化鈉注射液清洗創(chuàng)口，每日局部外用常規(guī)乳膏兩次，每次用無菌棉簽蘸取2 g常規(guī)乳膏均勻涂抹于創(chuàng)口表面。BMSCF治療組術(shù)后每日局部外用犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子液兩次，每次用1 mL的無菌注射器吸取0.2 mL干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液均勻滴加于創(chuàng)口表面。治療過程中發(fā)現(xiàn)創(chuàng)口有滲出物，在用藥前先用9 g/L氯化鈉注射液清洗創(chuàng)口，然后再用干細(xì)胞分泌因子液。用藥后分籠飼養(yǎng)，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)期間各組幼犬的相關(guān)情況。

1.2.4 石蠟切片及HE染色步驟 將手術(shù)切取下來的全層皮膚組織和術(shù)后新生皮膚組織放置10%甲醛溶液中固定。沖洗2 h～10 h后，依次脫水、放入二甲苯溶液中透明15 min～20 min、浸蠟、包埋、切片。切片后，置于50℃～60℃烤箱烤片2 h～3 h。放置于二甲苯溶液中5 min～10 min，之后置于酒精溶液中1 min～3 min。濃度依次為1 000、850、750 mL/L。蒸餾水浸泡。放入蘇木精溶液中5 min～10 min，用自來水清洗，每次約10 s～15 s。過鹽酸酒精浸洗3次，每次約3 s～5 s。再用蒸餾水水沖洗。放入5 g/L伊紅染液中5 min。然后將切片依次放入950 mL/L、1 000 mL/L酒精溶液中各1 min。最后放置在二甲苯溶液中2 min。

1.2.5 愈合指標(biāo)記錄 ①分別記錄比較對(duì)照組、常規(guī)治療組和BMSCF治療組創(chuàng)面愈合時(shí)間。②分別記錄比較對(duì)照組、傷富康組合和BMSCF治療組10 d、20 d、30 d創(chuàng)面殘留面積。③分別對(duì)對(duì)照組、傷富康組合和BMSCF治療組10 d、20 d、30 d 進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組犬創(chuàng)面愈合時(shí)間

觀察各組幼犬創(chuàng)面愈合時(shí)間。BMSCF治療組創(chuàng)面愈合過程順利，常規(guī)治療組犬創(chuàng)面修復(fù)亦順利，但BMSCF治療組與其和對(duì)照組相比，愈合時(shí)間差異極顯著(P<0.01)(表1)。對(duì)照組創(chuàng)面愈合時(shí)間最長，各組比較，BMSCF治療組幼犬創(chuàng)面恢復(fù)最佳。

表1 各組犬創(chuàng)面愈合時(shí)間

注：與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01) ； 與常規(guī)組相比，#表示差異顯著(P<0.05)；##表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Compared with control group，*means significant difference(P<0.05)；**Means extremely significant difference(P<0.01)；Compared with conventional treatment group，#Means significant difference(P<0.05)；##Means extremely significant difference(P<0.01).

2.2 創(chuàng)面愈合殘留面積

BMSCF和常規(guī)治療創(chuàng)面后，觀察創(chuàng)面愈合殘留面積，治療10 d后，BMSCF治療組創(chuàng)面明顯開始愈合，創(chuàng)面生長良好，露出粉紅色的肉面；治療20 d后，創(chuàng)面愈合面積增大，創(chuàng)面結(jié)痂明顯，無紅腫，無感染；治療30 d后，創(chuàng)面基本愈合，創(chuàng)面愈合無疤痕明顯，毛囊修復(fù)良好，毛干再生良好。常規(guī)治療組創(chuàng)面有小面積殘留。對(duì)照組犬創(chuàng)面30 d內(nèi)未完全愈合，創(chuàng)面有大面積殘留(圖1)。BMSCF治療組創(chuàng)面愈合殘留面積均小于各時(shí)期對(duì)照組和常規(guī)治療組，與對(duì)照組相比差異極顯著；與常規(guī)治療20 d和30 d相比，也具有極顯著的差異(P<0.01)(表2)。

2.3 組織切片HE染色觀察結(jié)果

組織切片HE染色犬創(chuàng)傷10 d后對(duì)照組皮膚層可觀察大量中性粒細(xì)胞浸潤，BMSCF治療組較少；治療20 d后 BMSCF治療組可見肉芽組織生長旺盛，少量新生血管，炎性細(xì)胞減少；治療30 d后BMSCF治療組可見大量新生血管和大量膠原纖維，排列規(guī)則，表皮細(xì)胞修復(fù)明顯可見，汗腺修復(fù)良好，毛囊生長豐富，常規(guī)治療組可見一些新生血管，未見明顯炎性細(xì)胞，膠原纖維排列稍亂，對(duì)照組仍可見炎性細(xì)胞，少量排列無序的膠原纖維。BMSCF治療組表皮細(xì)胞分化明顯，皮膚生長良好，對(duì)照組修復(fù)效果差(圖2)。

圖1 各組犬創(chuàng)面愈合殘留結(jié)果

組別 Groups10 d20 d30 d對(duì)照組 Control group8.723±0.0954.399±0.0691.075±0.028BMSCF組 BMSCF group8.043±0.124** #3.317±0.105** # #0**# #常規(guī)組 Conventional drug group8.466±0.0473.968±0.034**0.103±0.004**

注：與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01) ； 與常規(guī)組相比，#表示差異顯著(P<0.05)；##表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Compared with control group，*means significant difference(P<0.05)；**means extremely significant difference(P<0.01)；Compared with conventional treatment group，#means significant difference(P<0.05)；##means extremely significant difference(P<0.01).

3 討論

皮膚是機(jī)體的重要屏障，然而各種原因造成的皮膚缺損、難愈性創(chuàng)面及瘢痕的病例也在逐漸增加，給臨床治療來了很大的挑戰(zhàn)[11-12]。創(chuàng)面愈合主要的特征包括：組織再生、創(chuàng)面再上皮化和創(chuàng)面血管的新生。組織再生缺乏干細(xì)胞、促愈合細(xì)胞因子以及血管生成減少，都能導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難[13-15]。通過干細(xì)胞分泌因子來促進(jìn)創(chuàng)面的愈合及大面積軟組織損傷后的修復(fù)是一個(gè)全新思路。干細(xì)胞分泌因子能通過自分泌或旁分泌的方式改善受損部的微環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性干細(xì)胞向受損部位的遷移并分化，拯救即將壞死的細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)組織的目標(biāo)。它還是一種可以把被動(dòng)的機(jī)體自我修復(fù)轉(zhuǎn)換為主動(dòng)的外界主動(dòng)可控的治療手段。

干細(xì)胞分泌因子可以避免移植干細(xì)胞分化成組織細(xì)胞的低效率且移植存活時(shí)間短的缺點(diǎn)，其在治療創(chuàng)面損傷修復(fù)方面發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)式的調(diào)節(jié)作用。干細(xì)胞分泌因子中含有多種創(chuàng)面愈合相關(guān)因子，例如：抗炎細(xì)胞因子、血管發(fā)生因子、胞外基質(zhì)重塑因子以及纖維組織形成和表皮細(xì)胞再生因子[16]。同時(shí)分泌因子還具有能在體外大量生產(chǎn)、活性高和使用方便安全等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)通過對(duì)創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合殘留面積的分析發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞分泌因子可以快速地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，建模后，傷面愈合時(shí)間為27.66 d±0.87 d，其愈合時(shí)間較其他組均較短，各時(shí)相點(diǎn)干細(xì)胞分泌因子組創(chuàng)面愈合率均最高，創(chuàng)面愈合殘留面積最少，30 d左右傷面基本愈合。Kim Y M等[17]認(rèn)為干細(xì)胞分泌因子會(huì)促使干細(xì)胞在體內(nèi)遷移并分化，動(dòng)員機(jī)體其他部位的干細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)。同時(shí)，干細(xì)胞分泌因子在修復(fù)神經(jīng)的也參與創(chuàng)面愈合的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮改善毛細(xì)血管通透性和增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能；促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的增生，加快創(chuàng)面愈合速度；誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向創(chuàng)面和新鮮肉芽組織處遷移[18-21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分泌因子治療組與常規(guī)治療組及對(duì)照組比較，肉芽組織、成纖維細(xì)胞及新生血管生長更加明顯；對(duì)照組傷面膠原纖維束較少且排列無序，可能是干細(xì)胞分泌因子在促進(jìn)傷面愈合過程中使機(jī)體內(nèi)部增加分泌生長因子。

圖2 皮膚組織切片觀察(HE，400×)

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