王則緋，譚宏偉

(1 陜西省第四人民醫(yī)院，西安710043；2 西北婦女兒童醫(yī)院)

健康女性陰道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，定植著益生菌和條件致病菌[1]。乳酸桿菌在健康女性陰道中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，黏附于陰道上皮細(xì)胞，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等抑制病原菌生長(zhǎng)[2]。但是在某些因素，如雌激素水平降低、不潔性行為、抗生素濫用等作用下，陰道微生態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致一些條件致病菌過(guò)度生長(zhǎng)，引起陰道疾病，如細(xì)菌性陰道病(BV)和外陰陰道念珠菌病(VVC)等[3～5]。研究顯示，陰道加德納菌(Gv)和白色假絲酵母菌(Ca)分別是BV和VVC的主要致病菌，因此常將其作為指示菌[6，7]。盡管近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外日益重視益生菌的研究和開發(fā)，但是關(guān)于乳酸桿菌抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。國(guó)內(nèi)部分研究顯示了乳酸桿菌在體內(nèi)和體外的抗菌效果[8]，但是迄今為止，我國(guó)上市的陰道乳酸桿菌活菌制劑僅有德氏乳桿菌DM8909(商品名：定君生)一種，因此有必要繼續(xù)開發(fā)有利于預(yù)防和治療女性泌尿生殖道感染的乳酸桿菌制劑。本研究首先從本地健康婦女陰道分泌物中篩選出抑Gv/Ca效果明顯的8株乳酸桿菌，然后觀察其產(chǎn)生過(guò)氧化氫的能力、產(chǎn)生乳酸的能力、自聚合/共聚合能力以及產(chǎn)生生物膜的能力。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 陰道分泌物標(biāo)本取自2017年1～6月在我院門診接受孕前檢查的女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于月經(jīng)期；②1個(gè)月內(nèi)使用抗生素或者抗真菌藥物者；③1個(gè)月內(nèi)口服或者外用避孕藥者；④48 h內(nèi)曾經(jīng)陰道用藥或者陰道沖洗者；⑤半年內(nèi)曾經(jīng)被診斷過(guò)婦科或者泌尿系統(tǒng)炎癥性疾病者；⑥婦科檢查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性體征者。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的女性留取陰道后穹窿分泌物，行相關(guān)檢查除外細(xì)菌性陰道病、滴蟲性陰道炎、外陰陰道念珠菌病和性病、梅毒患者。共30例婦女納入本研究，入組者年齡18～30歲。取入組者陰道后穹窿分泌物標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組者均簽署知情同意書。

1.2 具有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌的篩選

1.2.1 人陰道乳酸桿菌菌株的分離和純化 將符合標(biāo)準(zhǔn)的健康女性陰道分泌物接種于MRS培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃厭氧培養(yǎng)(85 % N2、10 % H2和5 % CO2)48 h。挑選疑似乳酸桿菌菌落進(jìn)行革蘭染色，疑似乳酸桿菌菌落具有如下特征：革蘭染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，呈桿狀或球桿狀，單個(gè)、成對(duì)或者柵欄狀排列，無(wú)動(dòng)力；白色或乳白色菌落，呈圓形、扁平或者隆起、邊緣整齊、不透明；硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)和觸酶實(shí)驗(yàn)陰性，吲哚陰性，不液化明膠。用平板劃線法進(jìn)行分離培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)3～4個(gè)增菌-平板分離-再增菌-再平板分離的循環(huán)后得到純菌種。

1.2.2 獲得乳酸菌株分型 采用16S rDNA基因測(cè)序法將乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基中復(fù)蘇并活化培養(yǎng)3代，用試劑盒法提取其基因組。以細(xì)菌16S rRNA基因高保守區(qū)為靶點(diǎn), 所選寡聚核苷酸引物為SAdir：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和S17rev：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′，對(duì)該引物擴(kuò)增出16S rRNA序列片段。擴(kuò)增體系體積50 μL，含有200 μmol/L的dNTP，上下游引物各2 μmol/L，100 ng模板DNA， 2.5 U Taq DNA聚合酶，5 μL 10×PCR緩沖液 。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃孵育 3 min，然后 94 ℃ 60 s、50 ℃ 90 s、72 ℃ 2 min共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸6 min。PCR產(chǎn)物行0.8 %(w/v)瓊脂糖/TAE凝膠電泳，陽(yáng)性者送北京華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。用 BLAST程序進(jìn)行NCBI位點(diǎn)分析，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列相比較，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類菌種，從而確定菌株類型。

1.2.3 獲得乳酸桿菌菌株對(duì)指示菌的抑菌活性檢測(cè) 采用雙層瓊脂擴(kuò)散法評(píng)價(jià)篩選出的乳酸桿菌對(duì)指示菌(10種細(xì)菌和5種假絲酵母菌)的抑菌效果。各指示菌(細(xì)菌和假絲酵母菌)的培養(yǎng)條件如下：陰道加德納菌、羞怯動(dòng)彎桿菌和中間普雷沃菌培養(yǎng)選擇布氏肉湯，包含1%蛋白胨5號(hào)、0.2% Tween 80，0.3 %肉浸液、0.5 %血晶素、0.1 %維生素K和3 %馬血清。脆弱擬桿菌和普通擬桿菌培養(yǎng)選擇腦心浸液肉湯(BHI肉湯)，包含0.5 %血晶素和0.1 %維生素K。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。無(wú)乳鏈球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)選擇BHI肉湯,在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。白色假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、克魯斯氏假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌培養(yǎng)選擇沙氏葡萄糖肉湯。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。將乳酸桿菌(濃度109CFU/mL)接種于MRS固體培養(yǎng)基表面特定位置，于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。加入指示菌(細(xì)菌濃度109CFU/mL、假絲酵母菌濃度107CFU/mL)菌液的特定培養(yǎng)基混合液，通過(guò)無(wú)菌移液管至已接入乳酸桿菌的平皿中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)抑菌圈并測(cè)量抑菌圈直徑，從而篩選出對(duì)Gv/Ca有抑菌活性的乳酸桿菌。

1.3 有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌功能的觀察

1.3.1 對(duì)Gv/Ca抑菌活性的定量觀察 取篩選出的乳酸桿菌培養(yǎng)懸浮液或上清液與Gv或Ca進(jìn)行共孵育實(shí)驗(yàn)。所篩選乳酸桿菌菌株、Gv和Ca離心后，用無(wú)菌PBS洗滌3次后，重懸于各自新鮮肉湯中，使?jié)舛确謩e達(dá)到：乳酸桿菌108CFU/ mL或106CFU/mL、Gv 108CFU/ mL、Ca 106CFU/mL。乳酸桿菌培養(yǎng)上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后4 ℃保存?zhèn)溆?。? mL的乳酸桿菌懸浮液或者上清液，與等體積等濃度的Gv或者Ca在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中共孵育18 h。將乳酸桿菌、Gv或Ca培養(yǎng)液作10倍梯度稀釋并分別涂布MRS、Vaginalis瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)上。陽(yáng)性對(duì)照為等量Gv或Ca用等量新鮮MRS培養(yǎng)基孵育。

1.3.2 產(chǎn)過(guò)氧化氫(H2O2)能力觀察 將篩選出的乳酸桿菌濃度調(diào)定為109CFU/ mL。將0.5 mL菌液接種到含0.25 mg/mL TMB和0.01 mg/mL HRP的3 mL MRS肉湯中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后常氧培養(yǎng)30 min。采用Edema等[10]所描述的方法進(jìn)行定量分析。以嗜酸乳酸桿菌ATCC 4356作為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)基本身作為陰性對(duì)照。

1.3.3 產(chǎn)乳酸能力觀察 篩選出的乳酸桿菌菌液按1%比例接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。經(jīng)離心測(cè)定上清液pH值。通過(guò)酸堿滴定法測(cè)量乳酸桿菌乳酸的產(chǎn)生量，方法如Edema MO[10]所述。以嗜酸乳酸桿菌ATCC 4356為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)基本身作為陰性對(duì)照。

1.3.4 自聚合和共聚合能力觀察 參考Kos等[11]的方法。所篩選乳酸桿菌菌株、Gv和Ca離心后，用無(wú)菌PBS洗滌3次后，重懸于各自新鮮肉湯中，使?jié)舛确謩e達(dá)到：乳酸桿菌109CFU/ mL或107CFU/mL、Gv 109CFU/ mL和Ca 107CFU/mL。4 mL細(xì)胞懸液(自聚合)或者乳酸桿菌和Gv各2 mL的混合懸液(共聚合)或者乳酸桿菌和Ca各2 mL的混合懸液(共聚合)，經(jīng)蝸旋10 s后，放置在室溫下孵育5 h。分別在0 h和5 h取樣測(cè)量其在 600 nm下的吸光度A值，分別記為A0和A5。自聚合能力(%)= [ 1-(A5/A0)]×100%。共聚合能力(%)=2{[(Ax+Ay)/2]-A(x+y)}/(Ax+Ay)×100%。其中，Ax和Ay分別為單個(gè)微生物的吸光度，A(x+y)是指乳酸桿菌與Gv或Ca混合微生物的吸光度。共聚合定性實(shí)驗(yàn)500 μL乳酸桿菌與500 μL Gv或Ca混合，短暫蝸旋后，室溫下以50 r/min振蕩2 h。上清液進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察。存在大而濃厚的微生物叢定義為++，小而稀疏分散的微生物叢定義為+，無(wú)微生物叢定義為-。

1.3.5 生物膜形成能力觀察 參考Pérez-Ibarreche等[12]方法。乳酸桿菌菌株(109CFU /mL)用新鮮MRS按5% v/v稀釋后取200 μL加入無(wú)菌96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每株接種4孔，設(shè)置空白對(duì)照(同體積無(wú)菌MRS)。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。PBS洗板3次，將未黏附的乳酸桿菌洗去。晾干后，每孔加入200 μL的0.1 %結(jié)晶紫(w/v)染色30 min，去離子水沖洗未黏附的乳酸桿菌。晾干后每孔加入200 μL異丙醇-甲醇-PBS溶液(1∶1∶18)，輕微振蕩。去離子水沖洗2次，祛除過(guò)度染色。在酶標(biāo)儀下讀取每孔570 nm處的吸光度值(OD)。以陰性對(duì)照孔的A值(ODc)作為參考，計(jì)算OD/Odc≤1為無(wú)生物膜形成能力，1～2為生物膜形成能力弱，2～4為生物膜形成能力中，4～8為生物膜形成能力強(qiáng)，>8為生物膜形成能力極強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌的篩選經(jīng)過(guò)及結(jié)果 30名健康女性陰道分泌物中分離出51株菌，其中23株具有乳酸桿菌特征。對(duì)23個(gè)乳酸桿菌進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序，確定其中9個(gè)菌株為卷曲乳酸桿菌、7個(gè)菌株為植物乳酸桿菌、6個(gè)菌株為發(fā)酵乳酸桿菌、1個(gè)菌株為加氏乳酸桿菌。雙層瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共有8個(gè)菌株對(duì)Gv和/或Ca有抑菌作用：包括僅抑制Gv的2號(hào)菌株、僅抑制Ca的7、26和44號(hào)菌株以及對(duì)同時(shí)抑制二者的16、19、31和41號(hào)菌株。上述8個(gè)菌株即為篩選出的有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌，其拮抗Gv、Ca的平均抑菌圈直徑分別為18.94 、13.97 mm。

2.2 篩選出的有抑Gv/Ca菌活性人陰道乳酸桿菌的功能

2.2.1 對(duì)Gv/Ca抑菌活性 2、7、16、31、41號(hào)菌株共培養(yǎng)、上清液培養(yǎng)對(duì)Gv的抑菌活性見表1。7、16、19、26、31、41、44號(hào)菌株共培養(yǎng)、上清液培養(yǎng)對(duì)Ca的抑菌活性見表2。篩選出的8種乳酸桿菌與Gv共培養(yǎng)時(shí)，全部菌株均顯示了抑菌活性，其中41號(hào)菌株完全抑制了Gv的生長(zhǎng)；當(dāng)用乳酸桿菌培養(yǎng)上清液孵育Gv時(shí)，全部菌株培養(yǎng)上清液均顯示了明顯地抑菌活性。當(dāng)乳酸桿菌與Ca共培養(yǎng)時(shí)，全部菌株均顯示了抑菌活性；當(dāng)乳酸桿菌培養(yǎng)上清液孵育Ca時(shí)，全部菌株培養(yǎng)上清液均顯示了抑菌活性，其中19號(hào)菌株完全抑制了Ca的生長(zhǎng)。

2.2.2 產(chǎn)生H2O2、乳酸能力 各菌株pH值、乳酸生成量和H2O2生成量見表3。8個(gè)乳酸桿菌菌株pH值、乳酸生成量 和H2O2生成量與陰性對(duì)照菌株相比，P均<0.05。其中以19號(hào)和41號(hào)菌株的產(chǎn)酸和產(chǎn)H2O2能力最強(qiáng)，達(dá)到了陽(yáng)性對(duì)照菌株水平(P均>0.05)。

表1 2、7、16、31、41號(hào)菌株共培養(yǎng)和上清液培養(yǎng)對(duì)Gv的抑菌活性

注：與陰性對(duì)照菌株相比，*P<0.05。

表2 7、16、19、26、31、41、44號(hào)菌株共培養(yǎng)和上清液培養(yǎng)對(duì)Ca的抑菌活性

注：與陰性對(duì)照菌株相比，*P<0.05。

表3 乳酸桿菌菌株培養(yǎng)上清液中pH值、乳酸和H2O2水平

注：與陽(yáng)性對(duì)照菌株相比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照菌株相比較，#P>0.05。

2.3 自聚合/共聚合水平 Gv的自聚合水平為45.25 %，而Ca的自聚合水平則高達(dá)100 %。乳酸桿菌菌株16號(hào)(92.57 %)、19號(hào)(96.32 %)、31號(hào)(92.16 %)和41號(hào)(93.52 %)均顯示了明顯的自聚合能力。19號(hào)、26號(hào)和41號(hào)菌株顯示了與Ca較強(qiáng)的共聚合能力(定性均為++，定量分別為61.23 %、58.72 %和54.59 %)，其他菌株與Ca的共聚合水平為28.53 % ～ 44.21 %。16號(hào)、19號(hào)和41號(hào)菌株顯示了與Gv較強(qiáng)的共聚合能力(定性均為++，定量分別為82.34 %、83.41 %和93.56 %)，其他菌株與Ca的共聚合水平為41.33%～46.12%。

2.4 細(xì)菌生物膜形成情況 篩選出的8種乳酸桿菌均能夠形成生物膜，其中19號(hào)菌株最強(qiáng)，其次是41號(hào)菌株。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有10億女性患泌尿生殖道感染，目前的主要治療方法是抗生素。但是抗生素的長(zhǎng)期使用往往導(dǎo)致陰道微生態(tài)失衡，療效不佳，且易復(fù)發(fā)。利用微生態(tài)療法選擇乳酸桿菌來(lái)恢復(fù)陰道菌群失調(diào)和預(yù)防感染，是一種安全而有效的手段[13]。目前我國(guó)上市的陰道乳桿菌活菌制劑僅有德氏乳桿菌DM 8909(商品名：定君生)一種，因此有必要繼續(xù)開發(fā)有利于預(yù)防和治療女性泌尿生殖道感染的乳酸桿菌制劑。

本研究從健康婦女陰道后穹窿分泌物中分離出的23株乳酸桿菌中包括9個(gè)卷曲乳酸桿菌、7個(gè)植物乳酸桿菌、6個(gè)發(fā)酵乳酸桿菌和1個(gè)加氏乳酸桿菌菌株。Gv是BV最常見的致病菌[6]，Ca是VVC和復(fù)發(fā)性VVC的主要致病菌[7]，故我們進(jìn)一步篩選出對(duì)Gv和Ca具有較好抗菌活性的8株乳酸桿菌，并通過(guò)乳酸桿菌培養(yǎng)懸浮液和上清液與Gv或Ca共孵育的方法，進(jìn)一步證實(shí)了它們較強(qiáng)的抗菌活性。

乳酸桿菌產(chǎn)生H2O2是防止病原微生物或機(jī)會(huì)致病微生物定植的一個(gè)重要機(jī)制[14]。在陰道分泌物中，H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镽OS，例如超氧陰離子、羥基自由基，它們對(duì)許多微生物(如Gv、Ca和淋球菌等)和病毒顆粒(如人類免疫缺陷病毒-1等)具有高度毒性[15]。乳酸桿菌生成H2O2減少與BV、復(fù)發(fā)性尿路感染和人類免疫缺陷病毒-1敏感性增加明顯相關(guān)。乳酸桿菌有機(jī)酸的生成對(duì)于維持陰道pH值<4.5是至關(guān)重要的。本研究也顯示篩選的8個(gè)乳酸桿菌菌株良好的產(chǎn)生乳酸和H2O2能力，并且可以保持培養(yǎng)液較低的pH值，這些結(jié)果與先前報(bào)道的陰道乳酸桿菌可以作為益生菌的內(nèi)容相一致。

生物膜是一種原核生物多細(xì)胞聚合形式，是在不利條件下細(xì)菌維持生存所形成的一種特殊結(jié)構(gòu)。與單個(gè)細(xì)菌分散的浮游形式不同，它附著在非生物或生物活性表面，由自身產(chǎn)生的多聚基質(zhì)包裹細(xì)胞群落。自聚合是指相同遺傳背景的細(xì)菌發(fā)生相互聚集，共聚合是指懸浮液中不同遺傳背景的細(xì)菌相互黏合在一起。對(duì)于致病菌來(lái)說(shuō)，生物膜具有保護(hù)細(xì)菌、促進(jìn)細(xì)菌逃避機(jī)體免疫和對(duì)抗抗菌藥物的作用。但是對(duì)于乳酸桿菌來(lái)說(shuō)，生物膜形成和自聚合能力或許會(huì)產(chǎn)生有益效果，例如可能會(huì)增加乳酸桿菌在陰道上皮細(xì)胞的自身定植。本研究所篩選出的乳酸桿菌菌株均具有不同程度的自聚合和生物膜形成能力，其中19號(hào)和41號(hào)菌株的形成能力甚至達(dá)到了極強(qiáng)和強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)。本研究也顯示了篩選出的乳酸桿菌與Gv和Ca有共聚合能力，這也是其防止病原菌黏附的一個(gè)重要機(jī)制。

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