李淵 張然 宋普慶 李海 陳堅(jiān) 林龍山

(國家海洋局第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

0 引言

南大洋具有獨(dú)特的海洋生態(tài)環(huán)境, 常年低溫、海冰漂浮、初級(jí)生產(chǎn)力波動(dòng)劇烈等是其主要的特征, 而南極魚類則是該海域具有代表性的種類之一, 在食物網(wǎng)中具有重要的位置, 在經(jīng)歷了顯著的輻射進(jìn)化后已適應(yīng)了南極大尺度極端的生態(tài)系統(tǒng)[1]。南極魚類大部分為具有區(qū)域性特征的底棲魚類, 主要隸屬于鱸形目(Perciform)、南極魚亞目(suborder Notothenioidei), 其中常見的5個(gè)科為阿氏龍科(Artedidraconidae)、淵龍科(Bathydraconidae)、冰魚科(Channichthyidae)、裸南極魚科(Harpagiferidae)和南極魚科(Nototheniidae),而南極魚科種類占南極海域魚類種類的70%以上,生物量占91%以上[2]。

以線粒體COI基因部分序列作為DNA條形碼, 該技術(shù)一經(jīng)提出就被廣泛應(yīng)用[3], 因?yàn)樗鼘?shí)現(xiàn)了物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化, 不再完全依賴于樣品的完整性和鑒定者的經(jīng)驗(yàn)[4-5], 如今該標(biāo)記在物種鑒定方面的優(yōu)勢越來越明顯。在物種間的條形碼比較方面, 同種內(nèi)的差異較小, 而種間的差異顯著, 同時(shí)該標(biāo)記還被成功用于隱存多樣性發(fā)掘[6-7]、新紀(jì)錄種或新種的發(fā)現(xiàn)[8-9]及魚類浮游生物鑒定等方面的研究[2,5,10]。

Yelcho站(64°62′S, 63°35′W)是智利南極度夏科考站, 位于帕默群島(Palmer Islands), 有關(guān)該站周邊海域海洋生物的研究較少, 僅見智利南極研究所(Chilean Antarctic Institute, INACH)內(nèi)部研究報(bào)道, 而南極不同海域魚類的地域性較強(qiáng), 種類組成差異較大, 因此, 有必要采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)該海域的魚類樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的種類鑒定,積累南極魚類分子遺傳學(xué)信息, 也為今后不同海域南極魚類的比較研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與鑒定

基于中國第32次南極科學(xué)考察暨中智第2次聯(lián)合南極半島綜合科學(xué)考察, 于2016年2月在帕默群島Yelcho站周邊海域, 利用地籠網(wǎng)捕獲8尾南極魚類成魚。依據(jù)Fischer和Hureau[11]的分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有魚類樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定, 并對(duì)其進(jìn)行編號(hào),測量其體長和體重, 體長范圍為234—309 mm, 體重范圍為155.2—332.1 g。所有南極魚類中文名稱參考《拉漢世界魚類系統(tǒng)名典》[12]。所有樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)研究, 目前樣品保存在國家海洋局第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用剪刀剪取南極魚類適量背部肌肉組織進(jìn)行酒精固定, 采用DNA提取試劑盒提取總基因組DNA, 4℃保存?zhèn)溆?。用于擴(kuò)增COI片段的引物為[3]:F1: 5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′;R1: 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。PCR反應(yīng)體系為25 mL[13]: 0.15 μLTaqDNA聚合酶, 2.5 μL dNTP(2 mmol?L–1), 2 μL 10×Taq buffer(含Mg2+), 正反引物各1 μL(2 mmol?L–1), DNA模板1 μL, 其余dd H2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。對(duì)符合測序要求的純化PCR產(chǎn)物送生物有限公司進(jìn)行雙向測序。

結(jié)合形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果, 下載GenBank中革首南極魚(Notothenia coriiceps)、花紋南極魚(Notothenia rossii)、喬奇裸南極魚(Harpagifer georgianus)和伯氏肩孔南極魚(Trematomus bernacchii)的同源序列用于分子遺傳學(xué)比較分析(表1)。

表1 研究所用南極魚類樣品和序列信息Table1. Information of Antarctic fishes’ samples and investigated sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)測得的原始序列進(jìn)行比對(duì)及校正, 獲得目的片段用于后續(xù)分析。將所有序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列相似性比對(duì), 采用兩兩序列間遺傳相似度＞98%的為同一物種, 92%—98%為同一屬, 85%—91%為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)采集的南極魚類進(jìn)行比對(duì)和種類鑒定, 選取最佳匹配值(the best match)和種間最佳匹配值(interspecific best match)[5-6]。選取2%為種間的遺傳分化界限, 對(duì)所有比對(duì)結(jié)果劃分為3種模式[5,10]。模式Ⅰ是鑒定到種(match to species): 最佳比對(duì)值(the best match)低于遺傳分化界限, 最佳鄰接比對(duì)值(the nearest neighbor best match)高于遺傳分化界限, 該模式下能鑒定到種; 模式Ⅱ是模糊種(uncertain match):最佳比對(duì)值和最佳鄰接比對(duì)值均低于遺傳分化界限, 該模式下鑒定到的種是不確定的或者錯(cuò)誤的;模式Ⅲ是無法匹配種(unmatched): 最佳比對(duì)值和最佳鄰接比對(duì)值均高于遺傳分化界限, 該模式下由于條形碼參考數(shù)據(jù)庫(reference library)的限制導(dǎo)致物種無法鑒定?；贙2P模型利用Mega 4.0軟件計(jì)算各物種間的變異位點(diǎn)、簡約信息為點(diǎn)、種內(nèi)遺傳距離、種間遺傳距離、條形碼間隙(barcoding gap)等參數(shù), 并構(gòu)建鄰接關(guān)系樹[14-15]。

2 結(jié)果

2.1 分子多態(tài)性

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后, 發(fā)現(xiàn)8尾南極魚類中存在3個(gè)種, 分別為革首南極魚(Notothenia coriiceps)、伯氏肩孔南極魚(Trematomus ber-nacchii)和喬奇裸南極魚(Harpagifer georgianus)(表1)。為了進(jìn)一步確認(rèn)形態(tài)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,利用COI基因片段通用引物對(duì)8尾南極魚類進(jìn)行擴(kuò)增并雙向測序, 去除引物得到目的片段長度655 bp, 結(jié)合GenBank中的同源序列最終截取608 bp用于后續(xù)分析。8尾樣品中保守位點(diǎn)484個(gè), 變異位點(diǎn)124個(gè)(圖1), 簡約信息位點(diǎn)123, 單一信息位點(diǎn)1個(gè), 無插入/缺失位點(diǎn)。A+T堿基含量(53.5%)明顯高于G+C堿基含量(46.5%)(圖2)。

圖1 8尾南極魚類部分COI基因序列的變異位點(diǎn)Fig.1. Variable sites of partly sequences of COI gene among eight Antarctic fishes

圖2 8尾南極魚類部分COI基因序列的堿基組成比例Fig.2. Percentage of base composition of partly sequences of COI gene among eight Antarctic fishes

對(duì)所有8條目的序列進(jìn)行相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn),序列相似度(最佳匹配值)均在98%以上, 為了檢測比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 同時(shí)對(duì)每一個(gè)體的種間最佳匹配值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以相似度98%作為同一物種的界限(2%為種間的遺傳分化界限)對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示有2個(gè)個(gè)體屬于模式Ⅰ(25%),能準(zhǔn)確鑒定到種; 有6個(gè)個(gè)體屬于模式Ⅱ(75%),屬于模糊種, 個(gè)體Y2、Y3、Y5—Y8對(duì)應(yīng)兩種相似度在99%以上的物種(N. coriiceps和N. rossii);沒有個(gè)體出現(xiàn)在模式Ⅲ中(圖3)。

圖3 每個(gè)個(gè)體最佳匹配值和種間最佳匹配值之間的比較, 黑色線代表物種間分化的界限. Ⅰ-鑒定到種;Ⅱ-模糊種; Ⅲ-無法匹配種)Fig.3. Best match compared with nearest neighbor (similarity percentage) for each specimen. Dotted lines correspond to 2% divergence threshold for species boundaries. Ⅰ- match to species, Ⅱ- ambiguous species, Ⅲ- unmatched species

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

結(jié)合GenBank中下載的同源序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果顯示所有序列明顯分為4個(gè)組群,其中組群1有9條序列組成, 組群2、組群3和組群4均有3條序列組成(圖4)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn), 組群1為革首南極魚, 但其中KF412866是以N. rossii(花紋南極魚)為學(xué)名提交;組群2為花紋南極魚, 但KF412867是以N.coriiceps(革首南極魚)為學(xué)名提交; 組群3為喬奇裸南極魚, 其中HQ713152以Harpagifersp.學(xué)為名提交; 組群4為伯氏肩孔南極魚。

2.3 DNA條形碼間隙

基于核苷酸最佳替換模型K2P模型, 分別計(jì)算4個(gè)組群間和組群內(nèi)的遺傳距離(表2), 結(jié)果顯示各種間的遺傳距離范圍為0.039—0.176, 均高于2%的種間遺傳分化界限, 明顯為4個(gè)有效種;各組群內(nèi)的遺傳距離范圍為0—0.004, 均低于2%的種間的遺傳分化界限, 明顯屬于種內(nèi)差異。種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離基本符合種屬間的“10倍法則”[16]。4種南極魚類的最大種內(nèi)遺傳距均低于該物種的最小種間遺傳距離, 圖5顯示種間和種內(nèi)的遺傳距離間存在明顯的間隙, 即DNA條形碼間隙, 進(jìn)一步證實(shí)各物種的有效性。

圖4 基于所有個(gè)體構(gòu)建鄰接關(guān)系樹. 魚類圖片引自文獻(xiàn)[11]Fig.4. Neighbor-joining tree for all fish individuals based on COI sequences. Pictures of Antarctic fishes cited from reference [11]

表2 4個(gè)組群基于COI基因序列的組內(nèi)(對(duì)角線)和組間(下三角)的遺傳距離Table 2. Genetic distances of COI within (on the diagonal)and among (below the diagonal) four groups

3 討論

南極魚類不同海域間物種組成差異顯著[1-2],尤其在雪龍?zhí)柨瓶即瑹o法到達(dá)的Yelcho站海域采集的魚類樣品更顯得彌足珍貴, 因此有必要對(duì)采集到的魚類樣品進(jìn)行準(zhǔn)確物種鑒定, 為后續(xù)的研究提供科學(xué)參考。

圖5 基于K2P模型計(jì)算各物種的DNA條形碼間隙. 種間遺傳距離的最大值和最小值分別用上下橫杠進(jìn)行表示, 中間橫杠為中位值; 藍(lán)線代表最大種內(nèi)遺傳距離; 紅線代表平均種內(nèi)遺傳距離Fig.5. DNA barcoding gaps for all of the species based on the K2P model. Median interspecific distances with maximum and minimum values are represented by the upper and lower bars, respectively; Blue line:Maximum intraspecific distance; Red line: Mean intraspecific distance

由序列相似性比對(duì)結(jié)果看出, 8尾魚中僅2尾能準(zhǔn)確鑒定到種, 有6尾屬于模糊種。為了進(jìn)一步確認(rèn)物種的準(zhǔn)確性, 本研究結(jié)合GenBank中的同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), 所有序列明顯分為4個(gè)組群, 其中8尾樣品明顯分為3個(gè)組群。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可以確定組群1為革首南極魚,組群2為花紋南極魚, 組群3為喬奇裸南極魚, 組群4為伯氏肩孔南極魚。由系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出KF412866和KF412867均以錯(cuò)誤的學(xué)名進(jìn)行提交, 但筆者認(rèn)為造成這種錯(cuò)誤的原因是序列提交者在序列提交時(shí)混淆了序列編號(hào), 而非最初將兩種魚類進(jìn)行錯(cuò)誤鑒定, 畢竟這兩種魚類在胸鰭鰭條數(shù)上差異明顯(革首南極魚16—17 VS 花紋南極魚21—24)。Harpagifersp.(HQ713152)實(shí)際為喬奇裸南極魚。由此可以看出本研究不但對(duì)條形碼參考數(shù)據(jù)庫中的錯(cuò)誤序列進(jìn)行糾正, 還能對(duì)以前研究中的未定種類進(jìn)行種類鑒定。4個(gè)組群間的遺傳距離明顯高于種間遺傳分化界限, 而各物種的種內(nèi)遺傳距離均低于種間的遺傳分化界限, 基本符合種屬間的“10倍法則”[16], 且各物種內(nèi)均存在明顯的DNA條形碼間隙, 進(jìn)一步驗(yàn)證了各物種的有效性。

綜合上述結(jié)果可以看出, 以COI基因片段作為DNA條形碼與形態(tài)學(xué)相結(jié)合可成功用于南極海域魚類物種準(zhǔn)確鑒定, 8尾樣品內(nèi)存在3個(gè)有效種, 其中組群1可以作為革首南極魚鑒別的DNA條形碼,組群3可以作為喬奇裸南極魚鑒別的DNA條形碼,組群4可以作為伯氏肩孔南極魚鑒別的DNA條形碼; 獲取的樣品中有7尾南極魚科魚類, 1尾裸南極魚科魚類, 該結(jié)果也在一定程度上反映出Yelcho站周邊海域在物種組成和數(shù)量分布方面均以南極魚科魚類為主[2]。

因此, 將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)相結(jié)合對(duì)物種進(jìn)行分類才能確保物種鑒定的準(zhǔn)確性, 正確的形態(tài)鑒定能保證條形碼參考數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性,準(zhǔn)確的條形碼又能指導(dǎo)后續(xù)的物種鑒定[5], 二者相輔相成, 形成良好的物種鑒定循環(huán), 有助于今后的種類鑒定、隱存種的發(fā)現(xiàn)、多樣性調(diào)查及系統(tǒng)發(fā)育等研究。

4 結(jié)論

利用形態(tài)學(xué)和DNA條形碼技術(shù)能成功鑒定出Yelcho站附近海域采集到的8尾魚類樣品, 3種魚類的種內(nèi)和種間遺傳界限明顯, 基本符合種屬間的“10倍法則”, 且各物種內(nèi)均存在明顯的DNA條形碼間隙, 其中南極魚科魚類有7尾, 在一定程度上反映出Yelcho站周邊海域魚類在物種組成和生物量上均以南極魚科魚類為主。

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