徐劍欽，陳民利，劉軍平，陳嬌嬌，陳誠，潘永明,2*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州　310053； 2. 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州　310058)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以記憶減退和認(rèn)知功能障礙等為主的神經(jīng)退行性疾病，也是老年癡呆的主要類型[1]。AD主要病理特征包括細(xì)胞外大量β-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque, SP)、tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibril tangles, NFTs)和神經(jīng)元丟失[2]。但到目前為止，AD的病因尚未明確。臨床上僅有5%患者是以淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素1、早老素2基因突變?yōu)橹鞯募易逍訟D(familial AD, FAD)，而95%患者屬于散發(fā)性AD(sporadic AD, SAD)[3]，表明AD的發(fā)生與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)[4]。

動物模型是了解疾病的病因、發(fā)病機制以及防治藥物研發(fā)的主要研究手段。雖然目前尚無完全理想的AD模型，主要以APPswe / PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠、快速老化小鼠、或通過腦內(nèi)注射Aβ、鏈脲佐菌素、AlCl3造成細(xì)胞損傷等，且模型動物大多以大小鼠為主，但由于它們?nèi)狈φ_的APP序列和缺少觸發(fā)Aβ肽形成的切割酶[3]，使其并不適合作為SAD的天然模型。臨床試驗表明，在AD患者中Aβ依賴的信號傳導(dǎo)途徑不足以引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)衰退和癡呆[5-6]。但最近臨床流行病學(xué)、動物實驗和細(xì)胞研究表明高膽固醇可引起Aβ積累，高膽固醇血癥被認(rèn)為是AD發(fā)生的一個重要危險因素[7-9]。因此，研究人員正試圖通過膽固醇代謝與Aβ的關(guān)系，來揭示AD的病因和病理機制。Sparks等[8]首次應(yīng)用兔報道了膽固醇和Aβ斑塊之間的聯(lián)系，并進一步發(fā)現(xiàn)在兔中給予高膽固醇飼料的同時添加微量銅離子的飲水后，可在皮質(zhì)中觀察到淀粉樣蛋白沉積物以及至少十二種在人類AD患者腦內(nèi)也觀察到的病理特征[10]，包括學(xué)習(xí)障礙[11]。提示兔可作為于散發(fā)性AD模型動物，因其能自發(fā)產(chǎn)生Aβ肽的切割酶，且兔Aβ肽序列與人類相同[12]。白毛黑眼(White hair and black eye, WHBE)兔是由本中心自主培育的新的實驗兔品系，最近對WHBE兔腦MRI分析中，意外發(fā)現(xiàn)部分WHBE兔腦T2WI中顳葉海馬區(qū)信號增強[13]，表現(xiàn)出側(cè)腦室擴張、海馬萎縮的跡象，是否提示W(wǎng)HBE兔在神經(jīng)退行性疾病模型研究具有潛在的應(yīng)用價值。為此，本研究分別采用高膽固醇飲食、高膽固醇飲食添加微量銅飲水誘導(dǎo)WHBE兔散發(fā)性AD模型，并與老年WHBE兔比較，觀察各組腦部病理學(xué)的變化，為WHBE兔今后在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

普通級成年雄性白毛黑眼兔(WHBE rabbit)30只，體重為1.8～2.0 kg，3～4月齡；普通級老年雄性WHBE兔10只，體重為3.0～4.2 kg，36～48月齡，由新昌大市聚鎮(zhèn)欣健兔場提供【SCXK(浙)2015-0104】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心兔實驗室【SYXK (浙)2013-0184】，環(huán)境溫度20～22℃，濕度40%～60%，12 h/12 h明暗交替。所有操作均遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會要求(倫理批準(zhǔn)號：ZSLL-2016-115)。

1.1.2主要試劑與儀器

全自動生化分析儀(7020，日立公司，日本)，連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher公司，芬蘭)，徠卡病理切片儀(RM2245，徠卡公司，美國)，全自動病理掃描切片儀(Nanozoomer S210，濱松公司，日本)；總膽固醇(TC)試劑盒，購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和Aβ1-42 ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；β-amyloid抗體、β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)抗體、p-tau抗體，購自美國Santa Cruz公司。甲醇剛果紅(Congo red)染色試劑盒，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；皮爾蘇斯基氏(Bielschowsky)改良法神經(jīng)染色試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1散發(fā)性WHBE兔AD模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，成年WHBE兔隨機分成3組，即正常對照組(normal control group, NC)、高膽固醇飲食組(high cholesterol diet group, HCD)和高膽固醇飲食+銅水組(HCD+Cu2+group)，每組10只；另外10只老年WHBE兔作為老年組(senile)。正常對照組和老年組WHBE兔飼喂普通飼料和蒸餾水喂養(yǎng)；HCD組飼喂2%膽固醇飼料和蒸餾水喂養(yǎng)，HCD+Cu2+組飼喂2%膽固醇飼料和添加飲用含0.12 ppm銅離子(以硫酸銅的形式)蒸餾水，連續(xù)造模12周，并觀察動物的精神行為及活動情況。

1.2.2血漿TC和Aβ1-42水平測定

造模12周后，動物禁食不禁水12 h，空腹稱重，取耳中動脈肝素抗凝血2 mL，分離血漿，在全自動生化分析儀上測定血漿TC水平，并用ELISA法在連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上檢測Aβ1-42水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.3腦組織中SOD活性和MDA含量的測定

取部分皮質(zhì)和海馬組織各100 mg，以1∶9比例加入4℃冷生理鹽水，用組織勻漿機勻漿成10%勻漿液，然后在4℃ 3000 r/min離心20 min，吸取上清液，按試劑盒說明書測定腦組織中SOD活性和MDA含量。并采用考馬斯亮蘭法測定所有樣品的蛋白質(zhì)濃度，SOD和MDA水平標(biāo)準(zhǔn)化為樣品中的總蛋白質(zhì)含量。

1.2.4免疫組化法檢測Aβ、BACE-1、p-tau蛋白的表達(dá)

動物安樂死后，取出大腦行冠狀面切成5 mm厚小片，固定于4%甲醛溶液中至少24 h。用梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切成6 μm厚切片，并脫蠟至水，3%過氧化氫溶液滅活過氧化酶10 min，PBS液沖洗3次，滴加一抗：β-amyloid抗體(B-4，能識別APP和Aβ，1∶100)、BACE-1抗體(1∶100)、p-tau抗體(Thr231, 1∶300)，4℃孵育過夜。陰性對照用PBS替代一抗，PBS液沖洗3次，切片用二抗(HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG)室溫孵育1 h，PBS液沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，樹脂封片。圖像分析與陽性面積計算：濱松全自動病理掃描切片儀掃描切片，采用雙盲法隨機取400倍下4個不重復(fù)的視野圖像，用Image Pro Plus 6.0軟件分析所捕獲的圖像中被染成黃色或棕黃色物質(zhì)的陽性面積和統(tǒng)計場總面積，以陽性面積/統(tǒng)計場總面積比值作為腦皮質(zhì)和海馬中的陽性表達(dá)百分率。

1.2.5甲醇剛果紅染色觀察老年斑情況

取6 μm厚冠狀切片，脫蠟至水，入Mayer蘇木素染色10 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，溫水顯藍(lán)，水洗；甲醇剛果紅染色15 min，自來水沖洗數(shù)分鐘，0.2%堿性乙醇分化數(shù)秒鐘，水洗，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.6Bielschowsky改良法染色觀察神經(jīng)纖維纏結(jié)情況

取6 μm厚冠狀切片，脫蠟至水，加入預(yù)熱至37℃ Bielschowsky硝酸銀溶液避光浸染30 min；水洗，4%中性甲醛液還原數(shù)秒；用Bielschowsky氨銀溶液滴染30 s，傾去染液，再用4%甲醛液還原，水洗；用氯化金溶液調(diào)色，水洗，加入海波溶液作用5 min；水洗，脫水，透明，中性樹脂封固。神經(jīng)元、軸突、神經(jīng)纖維染成黑色。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　實驗動物一般觀察

造模12周后，正常對照組WHBE兔精神良好、活動好動、飲食正常，肢體健壯有力；HCD組WHBE兔有時出現(xiàn)眼瞼半閉等精神恍惚癥狀，活動尚可；HCD+Cu2+組WHBE兔時常出現(xiàn)眼瞼半閉等精神恍惚癥狀，甚至嚴(yán)重者出現(xiàn)前肢無力，常保持躺臥姿勢、活動減少，并對外來刺激反應(yīng)不敏感；老年組WHBE兔偶爾有眼瞼半閉等精神恍惚癥狀，活動有所減少，對外來刺激反應(yīng)相對較差。

2.2　各組WHBE兔的體重、血漿總膽固醇和Aβ1-42水平的變化

造模12周時，HCD組和HCD+Cu2+組WHBE兔的體重與正常對照組比差異無顯著性(P> 0.05)，而老年組WHBE兔的體重顯著高于正常對照組(P< 0.01)；另外，HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔的血漿TC和Aβ1-42水平均顯著高于正常對照組(P< 0.05,P< 0.01)(圖1)。

注：A. 體重；B. 總膽固醇水平；C. Aβ1-42水平。與正常對照組比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD組與HCD+Cu2+組比較，#P< 0.05, ##P< 0.01。圖1　各組WHBE兔的體重、總膽固醇和Aβ1-42水平的變化Note. A. Body weight. B. Total cholesterol (TC) level. C. Aβ 1-42 level. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+ group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.1　Changes of body weight, total cholesterol and Aβ 1-42 levels in the rabbit n=10)

注：A. 各組腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD活性水平；B. 各組腦皮質(zhì)和海馬組織中MDA含量。與正常對照組比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD組與HCD+Cu2+組比較，#P< 0.05, ##P< 0.01。圖2　各組WHBE兔腦組織中SOD活性和MDA含量的變化Note. A. The levels of SOD activity in the cortex and the hippocampus of each group. B. The MDA contents in the cortex and the hippocampus of each group. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+ group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.2　Changes of SOD activities and MDA contents in the brain tissues of the rabbit n=8)

2.3　各組WHBE兔腦組織中SOD活性和MDA含量的變化

與正常對照組比，HCD組和HCD+Cu2+組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD活性均顯著降低(P< 0.05)，MDA含量均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)；另外，老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD活性也顯著降低(P< 0.05)，海馬組織中MDA含量顯著升高(P< 0.05)，但腦皮質(zhì)MDA含量與正常對照組比差異無顯著性(P> 0.05)(圖2)。

2.4　各組WHBE兔腦組織中Aβ表達(dá)的變化

免疫組化染色顯示HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中Aβ免疫染色陽性表達(dá)比正常對照組明顯增加；定量分析顯示，HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中Aβ陽性表達(dá)百分率均顯著高于正常對照組(P< 0.05，P< 0.01)(圖3)。

2.5　各組WHBE兔腦組織中BACE1表達(dá)的變化

與正常對照組比，免疫組化染色顯示HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中BACE1陽性表達(dá)明顯增加；定量分析顯示，HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中BACE1陽性表達(dá)百分率均顯著高于正常對照組(P< 0.05，P< 0.01)；另外，HCD+Cu2+組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中BACE1陽性表達(dá)百分率均顯著高于HCD組(P< 0.05)(圖4)。

注：A. 各組腦皮質(zhì)和海馬組織中Aβ染色代表圖(×400)；B. 各組Aβ陽性表達(dá)百分率。與正常對照組比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD組與HCD+Cu2+組比較，#P< 0.05, ##P< 0.01。圖3　各組WHBE兔腦組織中Aβ表達(dá)的變化Note. A. Representative Aβ-staining images in the cortex and the hippocampus of each group (×400). B. The covered area of Aβ staining in each group. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs the HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.3　Changes of Aβ expression in the brain tissues of each n=8)

注：A. 各組腦皮質(zhì)和海馬組織中BACE1染色代表圖(×400)；B. 各組BACE1陽性表達(dá)百分率。與正常對照組比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD組與HCD+Cu2+組比較，#P< 0.05, ##P< 0.01。圖4　各組WHBE兔腦組織中BACE1表達(dá)的變化Note. A. Representative BACE1-staining images in the cortex and hippocampus (×400). B. The percentage of positive BACE1 expression area. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs the HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.4　Changes of BACE1 expression in the brain tissues of the rabbit n=8)

2.6　各組WHBE兔腦組織中p-tau表達(dá)的變化

免疫組化染色顯示HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中p-tau染色陽性表達(dá)比正常對照組明顯增加；定量分析顯示，HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中p-tau陽性表達(dá)百分率均顯著高于正常對照組(P<0.05，P<0.01)；另外，HCD+Cu2+組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬組織中p-tau陽性表達(dá)百分率均顯著高于HCD組(P<0.05,P<0.01)(圖5)。

注：A. 各組腦皮質(zhì)和海馬組織中p-tau染色代表圖(×400)；B. 各組p-tau陽性表達(dá)百分率與正常對照組比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD組與HCD+Cu2+組比較，#P< 0.05, ##P< 0.01。圖5　各組WHBE兔腦組織中p-tau表達(dá)的變化Note. A. Representative p-tau-staining images in the cortex and the hippocampus (×400). B. The percentage of positive p-tau expression area. Compared with the group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P<0.01.Fig.5　Changes of p-tau expression in the brain tissues of the rabbit n=10)

2.7　各組WHBE兔腦組織老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的觀察

剛果紅染色可反映老年斑沉積，結(jié)果顯示，正常對照組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬區(qū)未見紅色斑塊樣物質(zhì)沉積；HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬區(qū)可見有大量的紅色斑塊樣物質(zhì)沉積，主要沉淀在細(xì)胞外(圖6A)；Bielschowsky染色可反映神經(jīng)纖維纏結(jié)，結(jié)果顯示，正常對照組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬區(qū)未見黑色銀染的物質(zhì)沉積；HCD組、HCD+Cu2+組和老年組WHBE兔腦皮質(zhì)和海馬區(qū)可見有大量的火焰狀或球形的黑色銀染的物質(zhì)即為神經(jīng)纖維纏結(jié)(圖6B)。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)WHBE兔給予2%高膽固醇飼料12周后產(chǎn)生明顯的高膽固醇血癥、血漿Aβ1-42升高、氧化損傷、腦內(nèi)Aβ沉積增多和tau病理學(xué)等改變，且發(fā)現(xiàn)給予2%高膽固醇飼料同時添加微量銅飲水能進一步加重氧化損傷，其AD的形態(tài)和病理表現(xiàn)更為突出，而這與Sparks等[8]的研究較為一致。上述實驗結(jié)果提示，高膽固醇血癥能加劇AD的病理進程，同時腦內(nèi)銅代謝水平也與AD的進展有關(guān)，符合臨床顯示AD患者腦內(nèi)老年斑中有膽固醇沉積[14]，并在老年斑中心及周圍也存在高濃度的銅離子[15]；表明高膽固醇血癥是AD發(fā)生的一個重要危險因素。另外，在36～48月齡的老年WHBE兔中也觀察到輕微的高膽固醇血癥、氧化損傷、腦內(nèi)Aβ沉積增多和tau病理學(xué)等改變，表明年齡因素也是AD發(fā)生的危險因素[16]。同時，一般觀察顯示高膽固醇飼料或復(fù)合添加微量銅飲水的WHBE兔有表現(xiàn)出眼瞼半閉等精神恍惚的癥狀，甚至出現(xiàn)前肢肌肉無力的病癥，這與肌肉無力會增加老年人患AD的風(fēng)險符合?？梢?，高膽固醇飼料或復(fù)合添加微量銅飲水能誘發(fā)WHBE兔散發(fā)性AD模型的形成。

眾所周知，膽固醇作為神經(jīng)元細(xì)胞膜的基本成分之一，與Aβ代謝及異常聚集密切相關(guān)[17]。若腦內(nèi)膽固醇水平過高，使得神經(jīng)元細(xì)胞膜的脂質(zhì)循環(huán)減慢，導(dǎo)致Aβ生成和聚集增加。Helmuth等[18]發(fā)現(xiàn)血中膽固醇每升高10%，腦內(nèi)Aβ沉積就相應(yīng)增加1倍。相反，給予他汀類藥物降低膽固醇水平的同時，也能使AD的發(fā)生率降低60%～70%[19]。這些現(xiàn)象與本研究結(jié)果較為一致：無論老年期還是高膽固醇飲食的WHBE兔，不僅循環(huán)中膽固醇和Aβ水平均升高，同時也存在腦內(nèi)Aβ染色陽性的高表達(dá)和剛果紅染色老年斑增多，提示高膽固醇血癥影響Aβ代謝和Aβ異常聚集增加。

高膽固醇血癥與Aβ生成有關(guān)，但其機制還尚不清楚。目前認(rèn)為，高膽固醇血癥能提高分泌酶與β分泌酶的活性，促進淀粉樣前體蛋白的代謝，加劇Aβ沉積和老年斑的形成，導(dǎo)致AD的發(fā)生[20]。β-分泌酶(BACE1)是啟動Aβ生成的第一個蛋白酶，主要定位于脂筏上，并依賴于膽固醇代謝。其中富含膽固醇的脂筏是Aβ產(chǎn)生和聚集的主要原因。高膽固醇血癥促進Aβ水平升高與BACE1表達(dá)增加有關(guān)[21]；在散發(fā)性AD患者中BACE1活性也明顯上調(diào)，而在敲除BACE1基因的小鼠不產(chǎn)生Aβ，且表型正常[22,23]。本研究也發(fā)現(xiàn)老年期或高膽固醇飲食的WHBE兔腦內(nèi)BACE1陽性表達(dá)明顯上調(diào)，且在高膽固醇飲食并添加微量銅飲水的WHBE兔腦內(nèi)表達(dá)增加更為顯著，提示高膽固醇血癥激活了BACE1裂解酶活性，促進APP淀粉樣裂解途徑，最終導(dǎo)致Aβ沉積增多。

同樣，高膽固醇血癥也可引起氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA損傷[24]，氧化應(yīng)激還可促進Aβ聚集，并通過凋亡途徑損傷神經(jīng)元，而抗氧化物酶和維生素E可拮抗這種作用[25]。SOD是公認(rèn)氧自由基清除劑之一，MDA含量是反映自由基產(chǎn)生量和氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的敏感指標(biāo)[26]。本研究結(jié)果顯示，高膽固醇飲食或復(fù)合添加微量銅飲水的WHBE兔以及老年期的WHBE兔表現(xiàn)出腦內(nèi)SOD活性降低，MDA含量升高，存在明顯的氧化應(yīng)激，表明氧化應(yīng)激參與了AD的病理過程。

除Aβ病理外，tau蛋白過度磷酸化也是AD患者腦內(nèi)的又一病理性特征。tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，具有促微管形成和穩(wěn)定性的作用。在正常狀態(tài)下tau蛋白呈適度的磷酸化，但在AD患者中由于tau蛋白過度磷酸化，降低了微管組裝的能力，引起微管解聚，影響胞體和軸突樹突間的運輸、引起神經(jīng)元突起斷裂或變形解體，繼發(fā)神經(jīng)元退行性病變，導(dǎo)致NFTs[27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，無論老年期還是高膽固醇飲食的WHBE兔腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化明顯增加，且在給予高膽固醇飲食的基礎(chǔ)上添加微量銅飲水的WHBE兔腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化進一步加劇，同時，Bielschowsky染色顯示腦內(nèi)NFT明顯增加，表明散發(fā)性WHBE兔AD模型腦內(nèi)存在tau蛋白過度磷酸化進程，導(dǎo)致NFT形成。

本研究仍存在一定局限性，盡管Schreurs等[11]已報道了高膽固醇飼料或添加微量銅飲水誘導(dǎo)AD模型兔學(xué)習(xí)記憶功能的障礙，但本研究僅觀察了WHBE兔AD模型的一般行為活動，缺乏學(xué)習(xí)記憶能力的評估，仍需后期進一步完善WHBE兔AD模型的行為學(xué)評價。

綜上所述，高膽固醇飲食或復(fù)合添加微量銅飲水能誘導(dǎo)散發(fā)性AD模型WHBE兔腦部明顯的AD病理學(xué)變化，包括氧化損傷、腦內(nèi)Aβ沉積增多、老年斑和tau病理學(xué)等改變，WHBE兔可用于神經(jīng)退行性疾病動物模型的研究。