許 濤,王國英,岳秀萍 (太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山西 太原 030024)

反硝化是氮循環(huán)的重要組成部分,環(huán)境中的氮元素通過生化作用進(jìn)入到生物圈,再通過微生物反硝化作用以氮?dú)獾男问结尫诺娇諝庵衃1].現(xiàn)代反硝化理論認(rèn)為反硝化菌通常是一類兼性厭氧菌,當(dāng) O2充足時(shí),反硝化菌氧化分解有機(jī)物是以分子態(tài)氧作為最終電子受體.在缺氧或無氧條件下(污水處理中通常在 DO≤0.5mg/L[2]),反硝化菌則利用有機(jī)物作為碳源和電子供體來提供能量并以硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體.

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌約 50多個(gè)屬,130多個(gè)種[3],其中,環(huán)境中最普遍存在的好氧反硝化細(xì)菌為不動桿菌屬(Acinetobacter)[4]、紅球菌屬(Rhodococcus)[5]、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)[6]和農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)[7]等.這些細(xì)菌通過異養(yǎng)生長去除部分 NO3?-N同時(shí)利用硝酸鹽還原酶完成 NO3?-N 的反硝化.目前關(guān)于好氧反硝化菌的研究多集中于篩選、分離、鑒定和搖床內(nèi)研究菌種性能,并未有在發(fā)酵罐內(nèi)研究其特性的文章.發(fā)酵罐具有通氣量可控、轉(zhuǎn)速可調(diào)、在線監(jiān)測等一般搖床不具備的優(yōu)勢,因此探究好氧反硝化菌在發(fā)酵罐內(nèi)的生化特征很有必要.

本課題組前期從太原市煤氣化焦化廠生物池好氧段污泥中篩選分離得到一株反硝化菌Diaphorobacter sp. PDB3[8],并在搖床內(nèi)對該菌反硝化特征進(jìn)行了研究,但尚未在發(fā)酵罐內(nèi)研究該菌好氧反硝化特征.本文首先在 3L發(fā)酵罐內(nèi)研究比較不同碳源對 PDB3菌好氧反硝化特性的影響,采用響應(yīng)面法對影響 PDB3菌好氧反硝化條件(溫度、pH值、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、碳氮比)進(jìn)行優(yōu)化.最后通過氮平衡法和 RT-qPCR法分析了PDB3菌好氧反硝化過程中的脫氮途徑和脫氮基因的表達(dá)水平,為 PDB3菌的實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 好氧反硝化菌 Diaphorobacter sp.PDB3由本課題組篩選保藏[8].

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10.0,酵母浸粉5.0,胰蛋白胨10.0, pH值7.2,用于活化與富集菌株.

好氧反硝化培養(yǎng)基(DM,g/L):KH2PO41.0,Na2HPO42.0, MgSO4·7H2O 0.1, KNO31.0,微量元素溶液2.00mL[9],加蒸餾水溶解,實(shí)驗(yàn)中所有的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器具均需在 121℃高壓蒸汽滅菌器中滅菌20min.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將經(jīng)甘油冷凍保藏的菌種常溫放置解凍,取1%量接種于100mL LB液態(tài)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基用250mL錐形瓶置于搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)15h,培養(yǎng)條件為120r/min、30℃.

1.2.2 碳源影響 在 DM 培養(yǎng)基中使用葡萄糖、醋酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、苯酚和蔗糖作為碳源.通過固定C/N比(W/W)為8和恒定硝態(tài)氮濃度(NO3--N,138.6mg/L)來確定每個(gè)碳源的添加量.按 3%接種量將菌液轉(zhuǎn)移到裝有 2L DM培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(上海保興全自動發(fā)酵罐)中,在30℃、300r/min下培養(yǎng).定期收集10mL試樣用于測定細(xì)胞密度和化學(xué)分析.

1.2.3 優(yōu)化試驗(yàn)條件 響應(yīng)面法(RSM)[10]用于研究溫度、pH值、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、碳氮比等4個(gè)因素對 PDB3菌好氧反硝化活動的影響.控制不同溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、碳氮比等因素,分批發(fā)酵.根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)確定4個(gè)獨(dú)立變量的水平,進(jìn)行30個(gè)實(shí)驗(yàn)(表2).根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型,最終確定 PDB3菌在發(fā)酵罐內(nèi)好氧反硝化最佳條件,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析借助Design Expert 8.0.6軟件.

1.2.4 氮平衡分析 在 RSM 分析獲得的優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng) 12h,發(fā)酵液離心后取上清液測TN、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N、NO2--N,取沉淀測胞內(nèi)氮.

1.2.5 RT-qPCR分析 通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)測定PDB3菌株中脫氮基因 napA、nirS、nosZ、cnorB的表達(dá)水平.所有樣品總RNA提取和互補(bǔ)DNA(cDNA)合成分別用 RNAprep Bacteria Kit和 Fast Quant RT Kit進(jìn)行.16S rRNA基因用基因組 DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co,Ltd,China)提取 napA、nirS、cnorB、nosZ和V3[11-14]的引物序列和PCR擴(kuò)增片段的長度見表1,16S rRNA的V3區(qū)被證明是合適的管家基因(housekeeping gene)[15],其作為內(nèi)參基因來校正 cDNA量的差異帶來的表達(dá)量差異.對含有脫氮基因的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋并分別同時(shí)對內(nèi)參基因和脫氮基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)對各個(gè)樣本中內(nèi)參基因和脫氮基因進(jìn)行擴(kuò)增,然后從各自標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算待測樣本中內(nèi)參基因和脫氮基因的拷貝數(shù).qPCR的總體積為50μL,含有 2μL DNA 模板,15μL Taq PCR Master Mix(Tiangen Biotech Co,Ltd,China),正向和反向引物各 2μL(10μmol/L)和 29μL ddH2O.qPCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems 7300)反應(yīng)在以下條件進(jìn)行[15]: 95℃下預(yù)變性10min,接著完成40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括 95℃下變性 30s,56℃下(nosZ和nirS)或 60℃下(napA、cnorB 和 V3)退火 30s,最后在72℃下延伸30s.40個(gè)循環(huán)過后在72℃下延伸10min.

表1 引物序列和PCR擴(kuò)增片段的長度Table 1 Sequence of the primers and length of the PCR amplification segment

1.2.6 測定與分析方法[16]菌液濃度的測定采用可見分光光度法,取發(fā)酵液測定菌液的吸光度(OD600)值;根據(jù)細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值轉(zhuǎn)換為細(xì)胞干重;TOC和 TN用 TOC/TN分析儀(TOC-VCpH/TNM-1,日本島津)測量;胞內(nèi)氮用元素分析儀(EA3000,意大利歐維特)測量;有機(jī)氮等于TN減去NO3--N、NO2--N、NH4+-N 之和;NH2OH-N測定參照文獻(xiàn)[17]測定采用納氏試劑分光光度法;NO3?-N 測定采用酚二磺酸分光光度法;測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法.

吸光度(OD)值看成是時(shí)間的函數(shù),細(xì)胞比生長速率(μ)通過對生長曲線線性階段的擬合來確定.由于硝化產(chǎn)物的脫氮是不可避免的并且難以分別檢測它們的活性[7],故用總氮去除活性來表示在不同條件下的好氧反硝化脫氮比速率(ν),方程式如下:

式中:s是 TN的濃度,mg/L; x為微生物濃度,mg/L;t是反應(yīng)時(shí)間,h.

好氧反硝化過程中 4種脫氮基因(napA、nirS、nosZ、cnorB)的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理來校正cDNA量的差異帶來的表達(dá)量差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源影響

PDB3菌在利用不同碳源時(shí)對總氮去除率和細(xì)胞比生長速率的影響如圖 1所示,對于好氧反硝化菌來說,菌株對不同碳源的利用率差別很大.實(shí)驗(yàn)的 6個(gè)碳源中,PDB3菌在利用苯酚和蔗糖時(shí)總氮去除率和細(xì)胞比生長速率相對較低,表明它們均不能被該細(xì)菌很好利用.PDB3菌最初是以苯酚為底物從焦化廢水中篩選出來的[8,25],發(fā)現(xiàn) PDB3菌以其他碳源為底物均比以苯酚為底物時(shí)的反硝化效果要好.PDB3菌在利用丙酮酸鈉和檸檬酸鈉時(shí)總氮去除率均相對較高,但細(xì)胞比生長速率存在明顯差異,相比之下,檸檬酸鈉作為 PDB3菌的碳源更有利于菌株生長,這與王曉靜等[18]研究確定檸檬酸鈉為一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮的最佳碳源的結(jié)果一致.

圖1 不同碳源對PDB3菌總氮去除率和細(xì)胞比生長速率的影響Fig.1 Effects of various carbon sources on the specific growth rate and total nitrogen removal by strain PDB3

2.2 響應(yīng)面分析法確定影響因素的最佳條件

按照響應(yīng)面分析法中的 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,對影響菌株 PDB3好氧反硝化的4個(gè)因素即溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、碳氮比(C/N)進(jìn)行優(yōu)化,以菌種 PDB3好氧反硝化脫氮比速率(ν)為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì),結(jié)果見表 2.利用軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合得到模型方程:

式中:Y為菌種 PDB3好氧反硝化脫氮比速率值;A、B、C、D分別為pH值、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速的值.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

從Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果(表3)可得出,模型的相關(guān)系數(shù) R2=0.9975,表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值之間高度相關(guān).校正決定系數(shù)R2adj=0.9952,表明僅有 0.01%的好氧反硝化比速率值的變異不能被本模型解釋.失擬項(xiàng) 0.3633,差異不顯著;因此實(shí)測值能夠被本回歸模型很好的擬合,即可以用本模型來對 PDB3菌在發(fā)酵罐內(nèi)反硝化效果進(jìn)行分析和預(yù)測.

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis of the Box–Behnken design

由表3可知,模型方程的一次項(xiàng)A、B、C、D(P＜0.05)均影響顯著;二次項(xiàng) A2、B2、C2(P＜0.0001)影響均極顯著;交互項(xiàng) AB、AC、BC(P＜0.05)影響也均極顯著;交互項(xiàng)AD(P＞0.05)影響不顯著;可見各因素對響應(yīng)值影響并不是單純的線性關(guān)系,且對響應(yīng)值的影響存在某一極值點(diǎn),這一極值點(diǎn)恰是要尋找的最佳條件.根據(jù)模型方程可預(yù)測,當(dāng)pH值、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速分別為7.3、8.1、30.1℃、299.9r/min時(shí),PDB3菌在發(fā)酵罐內(nèi)好氧反硝化比速率達(dá)到2.25h-1.這與Alcaligenes sp.W1在pH值為7左右反硝化效果最佳[17]的研究結(jié)果一致.同時(shí)也與 Zhang等[19]和Huang等[20]在研究溶解氧對反硝化影響的結(jié)果接近.

根據(jù)模型方程作響應(yīng)面圖,分析pH值、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速對PDB3菌好氧反硝化比速率的影響,圖2為4個(gè)影響因素相互之間的響應(yīng)面,每個(gè)圖分別代表 2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用,此時(shí)另外2個(gè)變量保持在中心點(diǎn)水平[21].等高線的形狀反映出交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示兩者交互作用不顯著,橢圓形則表示兩者交互作用顯著[7].圖2中的(a)、(b)、(d)、(e)、(f)等高線呈橢圓形,而圖2(c)等高線呈近似圓形,表明pH值和C/N、溫度和pH值、溫度和C/N、轉(zhuǎn)速和C/N及溫度和轉(zhuǎn)速之間交互作用顯著,而轉(zhuǎn)速和 pH值之間交互作用不顯著.這與表2中AB、AC、BC、BD、DC值＜0.05,而AD值＞0.05相對應(yīng).

圖2 不同影響因素對PDB3菌好氧反硝化比速率影響的響應(yīng)面Fig.2 Response surface diagram of the effect of different influencing factors on the rate of aerobic denitrification of strain PDB3

2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本模型的有效性和準(zhǔn)確性,在預(yù)測的最佳條件下進(jìn)行初始 NO3--N 濃度為138.6mg/L的定量實(shí)驗(yàn).如圖3所示,通過將OD600值與 Logistic模型擬合和 NO3--N濃度與ExpDec1模型擬合來分別繪制PDB3菌株生長曲線和NO3--N 降解曲線.相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.995、0.981.表明模型方程均能夠充分描述PDB3菌株生長曲線和NO3--N降解特性.在接種前2h, OD600值增加緩慢,NO3--N濃度變化很小.這主要?dú)w因于 PDB3菌株需要時(shí)間來調(diào)整其新陳代謝以適應(yīng)新環(huán)境.隨后在 2～10h時(shí)間內(nèi)OD600值迅速增加,細(xì)胞比生長速率在2～4h內(nèi)達(dá)到最大,在4～7h內(nèi)又急劇下降,4h時(shí)菌株細(xì)胞比生長速率達(dá)到最大,μmax為 0.42h-1.對于一些反硝化菌,其最大細(xì)胞比生長速率約為 0.013～0.208h-1[22],表明PDB3菌株在最優(yōu)化條件下比這些反硝化菌生長更快.2～10h內(nèi)NO3--N濃度迅速下降.表明快速生長的菌株需要大量的氮源來維持自身代謝需要.最終在 12h,測得 PDB3菌好氧反硝化比速率為 2.12h-1,誤差僅為 5.8%,故驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值極為接近,可以認(rèn)為本模型準(zhǔn)確有效.

圖3 PDB3菌株生長曲線和降解NO3--N濃度曲線Fig.3 Growth curve of strain PDB3 and degradation curve of NO3--N

2.4 氮平衡分析

在 RSM 分析獲得的優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)12h,發(fā)酵液離心后取上清液測量TN、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N及NO2--N,取沉淀測胞內(nèi)氮.PDB3菌好氧反硝化發(fā)酵過程中各物質(zhì)氮含量如表4所示.最初NO3--N是氮源的唯一形式,故TN為277.2mg.隨著PDB3菌好氧反硝化及細(xì)胞同化作用的進(jìn)行,氨氮、羥胺、亞硝酸鹽氮及有機(jī)氮出現(xiàn)少量積累,王弘宇等[23]在研究兩株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的脫氮特性時(shí)發(fā)現(xiàn)有少量亞硝酸鹽積累,而張樹松等[24]在研究 Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205菌的好氧反硝化特性時(shí)發(fā)現(xiàn)沒有亞硝酸鹽積累,可見不同菌株的脫氮中間產(chǎn)物并不一樣.胞內(nèi)氮由初始2.04mg增長到78.3mg,增長量占去除總氮量的29.0%.存在 67.3%的氮損失,這部分氮最終以氮?dú)庑问奖蝗コ齕25].此外,PDB3菌在好氧脫氮過程中胞內(nèi)氮和氮損失共計(jì)占初始氮總量的96.3%,可見PDB3菌主要是通過好氧反硝化作用和細(xì)胞同化作用脫氮,這與其他好氧反硝化菌的研究結(jié)果一致[26-27].

表4 PDB3菌好氧反硝化過程中氮平衡分析Table 4 Analysis of nitrogen balance during aerobic denitrification by strain PDB3

2.5 RT-qPCR分析

在 RSM 分析獲得的優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng),測定PDB3菌好氧反硝化過程中脫氮基因napA、nirS、cnorB、nosZ的表達(dá)水平,以進(jìn)一步解釋脫氮特征.如圖4所示,圖中4種脫氮基因的表達(dá)水平為進(jìn)行歸一化處理后的相對表達(dá)量.napA基因表達(dá)迅速,在 1～3h保持較高水平,這可能與初始培養(yǎng)基中含硝酸鹽氮有關(guān).nirS、cnorB、nosZ的表達(dá)與napA基因的表達(dá)之間存在一個(gè)時(shí)間差.原因可能是這 3個(gè)基因的表達(dá)需要亞硝酸鹽[28].7h后亞硝酸鹽耗盡導(dǎo)致了nirS表達(dá)的快速降低.3～6h時(shí)cnorB的表達(dá)達(dá)到最高水平.cnorB、nosZ基因表達(dá)量比napA、nirS基因表達(dá)量約高一個(gè)數(shù)量級,這就保證胞內(nèi)有足夠的 NO還原酶和N2O還原酶合成以將NO和N2O濃度維持在較低水平.

圖4 PDB3菌好氧反硝化過程中4種脫氮基因的表達(dá)量Fig.4 Expression of four nitrogen removal genes in aerobic denitrification of strain PDB3

3 結(jié)論

3.1 得出檸檬酸鈉為PDB3菌好氧反硝化的最佳碳源.

3.2 利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)構(gòu)建出PDB3菌好氧反硝化的模型方程.模型預(yù)測結(jié)果表明 PDB3菌發(fā)酵罐內(nèi)反硝化最佳條件:pH值、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速分別為 7.3、8.1、30.1℃、299.9r/min;根據(jù)方程計(jì)算得到最佳好氧反硝化比速率為2.25h-1.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值極為接近,故可以認(rèn)為本模型準(zhǔn)確有效.

3.3 氮平衡分析表明,胞內(nèi)氮增長量占總氮去除量的29.0%.67.3%的氮以含氮?dú)怏w的形式被去除.此外,PDB3菌在好氧脫氮過程中胞內(nèi)氮和氮損失共計(jì)占初始總氮量的96.3%,PDB3菌主要是通過好氧反硝化作用和細(xì)胞同化作用脫氮.

3.4 研究了PDB3菌好氧反硝化過程中脫氮基因的表達(dá)水平.napA 基因表達(dá)迅速,并與 nirS、cnorB、nosZ基因的表達(dá)之間存在一個(gè)時(shí)間差.此外cnorB、nosZ基因表達(dá)量比napA、nirS基因表達(dá)量約高一個(gè)數(shù)量級,保證了體系中有足夠的NO還原酶和N2O還原酶合成以將NO和N2O的積累保持在低水平.

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