（1青海大學(xué)附屬醫(yī)院 青海 西寧 810001）

（2青海省第五人民醫(yī)院 青海 西寧 810001）

（3青海大學(xué)研究生院 青海 西寧 810001）

（4青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 青海 西寧 810001）

Rac1作為小GTPases蛋白家族Rac亞家族的成員之一，其成員主要包括Rac1、Rac2、Rac3、Rac1b等，這些成員在組織中呈非特異分布，具有GTP結(jié)合活性，當(dāng)與GTP結(jié)合時具有生物學(xué)活性，與GDP結(jié)合時活性喪失[1]。其活性調(diào)節(jié)的過程主要由鳥甘酸交換因子（GEF）、GTPases激活蛋白（GAPs）、鳥苷酸抑制因子（GDIs）所介導(dǎo)[2]。Rac1可促進肌動蛋白聚合，參與板狀偽足、絲狀偽足和黏著斑的形成調(diào)節(jié)細胞的遷移和黏附能力[3]。有研究表明Rac1在乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴細胞白血病等腫瘤中高表達[4]。Carolina E.等向結(jié)腸癌細胞sw620中分別轉(zhuǎn)染過表達野生型Rac1的質(zhì)粒和不表達Rac1的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者結(jié)腸癌細胞的表型明顯惡化，而后者結(jié)腸癌細胞幾乎停止增殖，提示Rac1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5]。Georgina A等使用Rac1抑制劑ZINC69391 處理惡性膠質(zhì)瘤細胞發(fā)現(xiàn)，6h后細胞增殖能力減弱，出現(xiàn)明顯的凋亡，24h后發(fā)生遷移的細胞數(shù)明顯減少，提示Rac1在腫瘤中主要發(fā)揮促增殖、抗凋亡及促進腫瘤遷移的作用[6]。Rac1對腫瘤細胞凋亡的調(diào)節(jié)主要是通過調(diào)節(jié)細胞周期及細胞骨架的形成來實現(xiàn)的。Huang YS等應(yīng)用RNA干擾技術(shù)或Rac1抑制劑降低結(jié)腸癌、乳腺癌細胞中Rac1表達后，均出現(xiàn)細胞凋亡率增加，G1期細胞數(shù)目增多，CyclinD1表達下調(diào)的現(xiàn)象[7-8]。Rac1對腫瘤遷移能力的調(diào)節(jié)與其對細胞骨架的影響密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，在肺癌細胞中轉(zhuǎn)染ITSN-1后肺癌細胞的增殖受到抑制，同時多余的ITSN-1將通過Cbl E3泛素化酶使Eps8發(fā)生泛素化，抑制Eps8與mSos形成復(fù)合體而損傷Rac1，損傷后的Rac1在ITSN-1的作用下形成較細的肌動蛋白束和較小的黏著斑，進而抑制肺癌細胞的遷移[9]。此外，Rac1還可通過促進腫瘤血管形成促進腫瘤遷移。乳腺癌中活化的Rac1/cdc42降低p53的表達量，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）增殖，促進乳癌遷移。同時，Rac1/cdc42的活化可使p53發(fā)生泛素化降低其穩(wěn)定性，促進血管的生成，進而促進乳癌的轉(zhuǎn)移[10]。

青海是全國胃癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病機制和涉及的相關(guān)細胞內(nèi)信號途徑一直未被闡明清晰，本研究通過對比胃癌患者和健康對照組之間Rac1在血清中的表達情況，了解其與胃癌易感關(guān)系，為胃癌的最終診療提供重要的實驗依據(jù)。

1.資料及方法

1.1 研究對象

收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省第五人民醫(yī)院胃癌患者80例；青海大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心收集健康體檢者血清80例，作為對照組。全部患者及健康對照組一般資料差異對比，無統(tǒng)計學(xué)意（P＞0.05）。

1.2 實驗設(shè)備與試劑

設(shè)備：iMax全波長酶標(biāo)儀（伯樂，美國），臺式冷凍離心機（Effendorf，德國），水浴鍋（北京六一，中國），恒溫培養(yǎng)箱（上海萬恒，中國）。

試劑：人Rac 1 Elisa試劑盒（武漢依萊普利，中國）。

1.3 方法

1.3.1 血清分離 將收集的胃癌患者及健康體檢者含抗凝劑的全血于4℃，以3000rpm/min離心8min，抽取上清約500μL于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準品配置 將人Rac1試劑盒于室溫下平衡30min，取出相應(yīng)凍干標(biāo)準品，以12000rpm/min在常溫下離心10min，加入對應(yīng)標(biāo)準品稀釋液1mL，輕輕搖動，于室溫下放置10min，使標(biāo)準品完全溶解，配置成已知濃度的標(biāo)準品；并取8個滅菌1.5mL離心管編號1-8，向1號離心管中加入200μL已知標(biāo)準品，其余各離心管中均加入100μL標(biāo)準品稀釋液，采用倍比稀釋法將已知濃度標(biāo)準品稀釋2、4、8、16、32及64倍。

1.3.3 Elisa酶鏈標(biāo)記反應(yīng)檢測 將配好的濃度梯度標(biāo)準品從低濃度到高濃度依次上樣于酶標(biāo)板，同時抽取各血清標(biāo)本100μL上樣于酶標(biāo)板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育90min。孵育結(jié)束后，于濾紙上將酶標(biāo)孔中液體拍干，將酶結(jié)合物濃縮液按1:100比例稀釋，以100μL加于各酶標(biāo)孔中，混勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育60min。生物素化抗體濃縮液按1:100的比例稀釋，以100μL的量加入各孔中，37℃孵育30min。待標(biāo)準品顏色梯度出現(xiàn)后，向各孔中加入50μL反應(yīng)終止液，于全波長酶標(biāo)儀450nm處檢測各孔吸光度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS19.0進行，數(shù)據(jù)以相對數(shù)表示，兩兩比較采用χ2檢驗，檢驗水準ɑ=0.05。

2.結(jié)果

2.1 胃癌患者血清Rac1表達水平

通過對胃癌和健康對照組血清Rac1表達情況的檢測，結(jié)果顯示，胃癌患者血清Rac1的陽性率為75%，而健康對照組血清Rac1的陽性率為33.75%，胃癌患者血清Rac1的陽性率顯著高于健康體檢者，兩組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（表1）。

表1 胃癌患者和健康體檢者血清Rac1陽性率

2.2 Rac1表達與患者臨床病理特征關(guān)系

通過對患者臨床病理特征資料與Rac1表達進行分析，發(fā)現(xiàn)Rac1在血清中的表達水平與患者性別、年齡無關(guān)（P＞0.05）。但是，Rac1表達在低分化胃癌和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中較高，與高中分化胃癌組織、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織相比具有顯著差異性（P＜0.05）（表2）。

表2 胃癌患者血清Rac1的陽性率與臨床病理特征

3.討論

Rac1是G蛋白家族成員之一，位于7號染色體，具有GTP激酶活性，可與GTP或GDP結(jié)合，當(dāng)其與GTP結(jié)合時具有生物學(xué)活性，可參與應(yīng)力纖維、黏著斑的形成，調(diào)節(jié)細胞骨架重塑、板狀偽足及片狀偽足的形成，維持細胞極性，進而調(diào)節(jié)細胞的遷移及增殖能力。有研究表明，Rac1在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤中高表達，且其在腫瘤中的表達量變化與腫瘤的遷移能力成正相關(guān)[11]。另有研究表明，Rac1可通過活化PAK1等下游分子激活LIMK1,后者與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遷移、侵襲能力有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清中Rac1的陽性率高于健康體檢者，且低分化胃癌患者血清Rac1的陽性率高于高中分化胃癌患者，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者血清Rac1陽性率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而與患者的性別及年齡無關(guān)。提示血清Rac1的陽性率與胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)。

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