謝長樂，羅育豪，黃旭純，許鎰洧

世界范圍內(nèi)，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，由于惡性程度高、腫瘤增殖迅速等原因，乳腺癌的死亡率仍然居高不下，而且乳腺癌的發(fā)病年齡有年輕化的趨勢[1]。傳統(tǒng)的乳腺癌檢查方法，包括乳房X線檢查、超聲、磁共振等，用于早期篩查乳腺癌并不十分有效[2-3]。例如，乳房X線檢查有很高的假陽性結(jié)果，并且在一些女性群體的診斷敏感度不夠高[4]。當(dāng)前，我們迫切需要尋找新的乳腺癌生物標(biāo)志物，可以更加簡單、有效、非侵入性地發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌。NY-ESO-1是癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)亞家族之一，本研究分析了NY-ESO-1自身抗體在乳腺癌患者血清中的水平，評價其作為乳腺癌早期診斷分子標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年10月—2013年6月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌患者125例和乳腺良性腫瘤患者33例。入組條件：未接受任何抗癌治療，并經(jīng)過組織病理學(xué)檢查確診。125例乳腺癌患者均為女性，年齡40～72歲，中位年齡51歲。33例乳腺良性腫瘤患者均為女性，年齡31～68歲，中位年齡46歲。正常對照為116例年齡與乳腺癌組匹配的女性體檢者并被證實(shí)為無任何腫瘤疾患，年齡41～70歲，中位年齡50歲。所有受試者空腹靜脈采血3 mL，1 250×g離心10 min，分離血清并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司)，96孔酶標(biāo)板(江蘇海門浩天生物器材廠)，NY-ESO-1重組蛋白和兔抗NY-ESO-1多克隆抗體(舟山同生生物科技公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG或羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)(廈門英科新創(chuàng)公司)。

1.3 NY-ESO-1自身抗體的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者和正常對照者血清中NY-ESO-1自身抗體。將NY-ESO-1重組蛋白用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋到終濃度0.1 μg/mL，包被96孔板4 ℃過夜。棄去孔內(nèi)溶液，用含吐溫-20的PBS(PBST)洗板3次。每孔加入200 μL封閉液(PBST+1%牛血清白蛋白)，37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次。加入1∶110稀釋的血清樣品和質(zhì)控樣品(取自50例乳腺癌患者的混合血清)，封閉液作為陰性對照，兔抗NY-ESO-1多克隆抗體作為陽性對照，每孔100 μL，每個樣本、陰性對照和陽性對照均做2平行孔，37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次；加入1∶10 000稀釋的HRP羊抗人IgG或羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板5次；每孔加入TMB-過氧化氫顯色液100 μL，置于37 ℃避光顯色15 min；加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀以測定波長為450 nm，校正波長為630 nm時檢測各樣品的A值(即A450 nm～A630 nm)。116例正常對照血清光密度(optical density,OD)值的均數(shù)加上2個標(biāo)準(zhǔn)差為判斷臨界值(Cut-off值)，大于等于此值為陽性，小于此值為陰性。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者和健康體檢者血清NY-ESO-1自身抗體的水平 與正常對照組(0.092±0.067)相比，血清NY-ESO-1自身抗體的平均滴度水平在乳腺癌組(0.223±0.217)和乳腺良性腫瘤組(0.132±0.080)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-6.842,P<0.0001；Z=-2.791,P=0.005,圖1)。乳腺癌組患者血清NY-ESO-1自身抗體的平均滴度高于乳腺良性腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.284,P=0.022，圖1)。

圖1 NY-ESO-1自身抗體在正常對照、乳腺良性腫瘤和乳腺癌患者血清中的水平

2.2 NY-ESO-1自身抗體檢測乳腺癌的診斷價值 ROC曲線分析顯示，與健康體檢者比較，NY-ESO-1自身抗體對乳腺癌的診斷AUC值為0.575(95%置信區(qū)間：0.695～0.816)。根據(jù)Cut-off值的判斷標(biāo)準(zhǔn)，NY-ESO-1自身抗體對乳腺癌的診斷Cut-off值為0.226。此時，檢測NY-ESO-1自身抗體的敏感度為31.2%，特異度為96.6%。當(dāng)以相同Cut-off值時，NY-ESO-1自身抗體區(qū)分乳腺癌和乳腺良性腫瘤的AUC值為0.629(95%置信區(qū)間：0.531～0.728)，敏感度為31.2%，特異度為87.9%。圖2。

圖2 血清NY-ESO-1自身抗體區(qū)分乳腺癌和健康體檢者(A)以及乳腺癌和乳腺良性腫瘤(B)的ROC曲線

3 討論

利用血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌具有簡單、方便等優(yōu)勢，但是臨床上常用腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)，如CA153、癌胚抗原等，其靈敏度和特異度均低。因此發(fā)現(xiàn)新的高靈敏度、高特異度的血清學(xué)篩查指標(biāo)具有重要的臨床意義。近年來的研究表明，針對腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體是非常有前景的腫瘤早期診斷分子標(biāo)志物，其在血液中穩(wěn)定、檢測方便，并且在腫瘤早期階段、甚至是在沒有臨床癥狀的癌前病變階段就可以被檢測出。如今，通過各種檢測技術(shù)，包括重組克隆表達(dá)抗原的血清學(xué)鑒定、血清蛋白質(zhì)組分析技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、蛋白芯片等，至少2 000種以上的腫瘤自身抗體被鑒定[5]。多種自身抗體標(biāo)志物被證實(shí)與乳腺癌早期檢測存在相關(guān)性，其中研究最廣泛的是針對p53、c-myc、Her2、Muc1和survivin等的自身抗體[6]。然而，由于這些乳腺癌自身抗體或自身抗體組合并沒有足夠的敏感度和特異度，因此沒能進(jìn)一步在臨床上應(yīng)用。由此可見，尋找更具代表性、高敏感度和特異度的乳腺癌自身抗體是十分重要的。

CTA作為一組腫瘤抗原，通常只在人類生殖細(xì)胞中有表達(dá)，但也被證實(shí)在多種腫瘤中有表達(dá)。CTA已被證實(shí)為多種惡性腫瘤的潛在診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)[7]。作為最主要的CTA，NY-ESO-1最初是在針對食管癌的重組克隆表達(dá)抗原血清學(xué)鑒定中被發(fā)現(xiàn)的。在表達(dá)NY-ESO-1的腫瘤患者，NY-ESO-1能夠引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[8]。研究表明，大約10%～50%的腫瘤患者中NY-ESO-1能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體反應(yīng)[9-10]。我們先前的研究表明，NY-ESO-1自身抗體在食管癌和鼻咽癌患者血清中水平升高[11-13]，提示NY-ESO-1自身抗體可能在多種腫瘤患者血清中高表達(dá)。Chapman等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NY-ESO-1自身抗體診斷乳腺癌的敏感度為26%，特異度為94%。Oshima等[15]檢測了365例乳腺癌和74例正常對照者血清中NY-ESO-1自身抗體的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1自身抗體在乳腺癌患者血清中水平升高。本研究中，我們采用ELISA試驗檢測了125例乳腺癌患者、33例乳腺良性腫瘤患者和116例健康體檢者血清中NY-ESO-1自身抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1自身抗體不僅可以區(qū)分乳腺癌和健康體檢者，還能夠區(qū)分良惡性乳腺腫瘤，研究結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果較一致，進(jìn)一步證實(shí)了NY-ESO-1自身抗體對乳腺癌具有一定的診斷價值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1自身抗體在乳腺癌的診斷中具有較好的價值，而且具有無創(chuàng)、無放射風(fēng)險，如果聯(lián)合其他自身抗體，進(jìn)一步提高敏感度，無疑將具有臨床推廣的可能性?？紤]到研究樣本量小以及缺乏多中心驗證等不足之處，今后仍需進(jìn)行高質(zhì)量的病例對照研究，以進(jìn)一步證實(shí)NY-ESO-1自身抗體在早期診斷乳腺癌中的作用。

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