陳強(qiáng) ， 靳廣毅 ， 林桂淼，劉好，許改霞，王曉梅，*

（1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東深圳518060；2.深圳大學(xué)光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

早在上世紀(jì)70年代，一些科學(xué)家報(bào)道了精子與體細(xì)胞體外融合的生物現(xiàn)象[1-3]。然而，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)能力限制，這些實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有對(duì)精子與體細(xì)胞融合所形成的嵌合細(xì)胞的生物學(xué)性狀進(jìn)行深入研究。直到本世紀(jì)初一些研究開(kāi)始關(guān)注精子與體細(xì)胞融合所形成的嵌合細(xì)胞的生物學(xué)特征。目前可以證實(shí)的是精子染色體在嵌合細(xì)胞中能夠經(jīng)去致密過(guò)程而活化，并能夠表達(dá)其所攜帶的遺傳信息[1，4]。2004年Khosrotehrani等[5]報(bào)道：在同一婦女的多個(gè)不同組織和器官可同時(shí)存在含有Y染色體的嵌合細(xì)胞，說(shuō)明了這些細(xì)胞的同源性，同時(shí)也證實(shí)了嵌合細(xì)胞的干細(xì)胞樣特征和較高的遷移能力。隨后的一些研究顯示，造血細(xì)胞較其他類(lèi)型外周血細(xì)胞具有更高的嵌合細(xì)胞比例[6-7]，而新生的肝組織中嵌合細(xì)胞的比例也顯著高于非新生肝組織[8]，這些研究均提示嵌合細(xì)胞與正常體細(xì)胞在生物學(xué)性狀方面的差異和干細(xì)胞樣特征。

我們已采用體外共培養(yǎng)的方法[9]，建立了穩(wěn)定的精子與腫瘤細(xì)胞融合模型，并采用自主合成的精子與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)基(sperm-tumor co-culture medium，STCM)，對(duì)融合模型進(jìn)行了優(yōu)化。本項(xiàng)研究在體外以精子與宮頸癌HeLa細(xì)胞融合模型為主要研究對(duì)象，對(duì)精子與腫瘤細(xì)胞融合的時(shí)效性、細(xì)胞接種密度依賴性及細(xì)胞類(lèi)型特異性進(jìn)行了分析。在體內(nèi)則以臨床收集的宮頸癌標(biāo)本為主要研究對(duì)象，分析嵌合型細(xì)胞在宮頸癌組織中是否存在以及Y染色體特異編碼基因在嵌合型細(xì)胞的表達(dá)。本研究的目的在于探討精子與腫瘤細(xì)胞融合過(guò)程的生物學(xué)特征，為嵌合型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的研究奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24孔板(Corning Costar)、35mm培養(yǎng)皿(Corning Costar)、濾孔直徑40 μm的過(guò)濾皿(Thermo Scientific)、嵌套式的培養(yǎng)皿/板(Corning Costar)、96孔板 (Corning Costar)、 石蠟 組 織DNA提取試劑盒(Thermo Scientific)。

8~10周齡雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫編號(hào)44007200016312)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，半晝半夜，自由取食、取水。經(jīng)1周左右適應(yīng)期后的動(dòng)物用于精子獲取。

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞系(表1)均為深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院納米磁實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞維持及凍存、復(fù)蘇均按照美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American TYPE Culture Collection，ATCC)推薦的方法進(jìn)行。

表1 實(shí)驗(yàn)中涉及的細(xì)胞系及其培養(yǎng)條件

1.3 細(xì)胞融合的時(shí)效性研究

小鼠精子獲取、精子與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)以及精子與腫瘤細(xì)胞融合率估算方法均按照我們先前提供方法[9]進(jìn)行。

將HeLa細(xì)胞接種于24孔板，待每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)為4~8個(gè)時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每30min設(shè)置1個(gè)取樣點(diǎn)，持續(xù)5h，共計(jì)10個(gè)取樣點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)一個(gè)空白對(duì)照(不添加精子)和一個(gè)陰性對(duì)照(嵌套式培養(yǎng)體系)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)束后以四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide，MTT)法估算各個(gè)取樣點(diǎn)殘存于孔板底部腫瘤細(xì)胞數(shù)量百分比(共培養(yǎng)組吸光度值/陰性對(duì)照吸光度值)。

1.4 細(xì)胞融合時(shí)細(xì)胞接種密度的研究

HeLa、HEp-2、H441和MCF-7細(xì)胞系(均為人類(lèi)來(lái)源的腺癌細(xì)胞系)被用于細(xì)胞接種密度依賴性研究。每種細(xì)胞分別以30~40/mm2的密度接種于24孔板。待每個(gè)細(xì)胞集落的細(xì)胞數(shù)分別為1~2個(gè)、3~5個(gè)及8~12個(gè)時(shí)分別進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，持續(xù)4h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以MTT法估算各實(shí)驗(yàn)組精子與腫瘤細(xì)胞的融合率。

1.5 細(xì)胞融合的細(xì)胞類(lèi)型特異性研究

我們選取了HeLa、HEp-2、H441等十余種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行與精子融合的細(xì)胞類(lèi)型特異性研究。每種細(xì)胞均以30~40/mm2的密度接種于24孔板，每種細(xì)胞接種4孔，接種24h后進(jìn)行精子的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，持續(xù)4h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以MTT法估算各實(shí)驗(yàn)組的精子與腫瘤細(xì)胞的融合率。為排除小鼠個(gè)體差異對(duì)融合率的影響，每次實(shí)驗(yàn)均包含HeLa細(xì)胞，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)HeLa細(xì)胞與精子的融合率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 嵌合型腫瘤細(xì)胞單克隆株的獲得及鑒定

利用自制吸卵針于超凈工作臺(tái)內(nèi)倒置相差顯微鏡(IX71，Olympus)下吸取共培養(yǎng)2h后漂浮于培養(yǎng)基上層的單個(gè)腫瘤細(xì)胞，并迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。12h后對(duì)96孔板內(nèi)各孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，選取單個(gè)細(xì)胞孔為假定的嵌合型腫瘤細(xì)胞單克隆株。待假定的嵌合型腫瘤細(xì)胞單克隆株細(xì)胞達(dá)到 1×107個(gè)后，部分細(xì)胞進(jìn)行凍存，取 1 ×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行DNA的提取。DNA的提取使用Thermo Scientific公司試劑盒按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA先在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行常規(guī)定量，然后以PCR進(jìn)行小鼠Y染色體特異編碼的性別決定基因(sex-determinating region on theY chromosome， S RY)的擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。相關(guān)引物按照GenBank提供的基因序列自行設(shè)計(jì)，正向引物：5′-cat cggagggctaaagtgtca-3′；反向引物：5′-ctactccagtcttgcctgt atgtg-3′。小鼠 G APDH基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)作為本研究的內(nèi)參照，相關(guān)引物按照GenBank提供的基因序列自行設(shè)計(jì)，正向引物：5′-tcaacggcacagtcaaggc-3′；反向引物：5′-tccacgacatactcagcacc-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)按如下步驟進(jìn)行：95℃、5min；95℃、5s，56℃、20 s，72℃、20s，35個(gè)循環(huán)； 72℃、 5min。

1.7 臨床宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細(xì)胞的篩檢

20例宮頸癌石蠟切片標(biāo)本由深圳市第一人民醫(yī)院病理科提供。石蠟組織DNA提取按照試劑盒(Thermo Scientific)使用說(shuō)明進(jìn)行。首先以PCR的方法進(jìn)行βactin基因的擴(kuò)增以鑒定提取的DNA質(zhì)量。然后進(jìn)行TSPY基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增所需引物均根據(jù)GenBank提供的序列自行設(shè)計(jì)： β-actin正向5′-agcgcaagtactccgt gtg-3′，反向5′-a a gcaatgctatcacctccc-3′；TSPY正向5′-gggagggtaagggaaataa-3′， 反 向5′-t a ctgggcatcaaacagct-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟如上述PCR實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 TSPY基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果由Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)在線軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

精子與腫瘤細(xì)胞的融合率以x±s的形式表示，以方差分析(ANOVA)進(jìn)行融合率的比較。所有數(shù)據(jù)分析均以SPSS16.0軟件進(jìn)行，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 精子與腫瘤細(xì)胞融合的時(shí)效特征

共培養(yǎng)的前1.5h殘存的腫瘤細(xì)胞數(shù)量迅速降低(圖1)，此后雖然可見(jiàn)共培養(yǎng)體系中運(yùn)動(dòng)活躍的精子，但殘存的貼壁細(xì)胞數(shù)量并未發(fā)生顯著改變。

圖1 精子與腫瘤細(xì)胞融合的時(shí)效特征

2.2 精子與腫瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞密度依賴性

當(dāng)接種的細(xì)胞密度較高(8~12個(gè))時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)不足10%的HeLa細(xì)胞能夠與精子融合，而當(dāng)細(xì)胞接種密度較低(1~2個(gè))時(shí)，超過(guò)50%的HeLa細(xì)胞能夠與精子融合(圖2)。而且我們?cè)?種不同類(lèi)型的細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)隨細(xì)胞接種密度的升高，精子與腫瘤細(xì)胞的融合率呈明顯的下降趨勢(shì)(圖2)。

圖2 精子與腫瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞密度依賴性

2.3 精子與腫瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞類(lèi)型特異性

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖 3)顯示腺癌來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系與精子的融合率顯著高于其他腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系(P<0.01)；而除腺癌外的其他腫瘤細(xì)胞系與精子的融合率顯著低于正常細(xì)胞系(P<0.01)。

圖3 精子與腫瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞類(lèi)型特異性特征

2.4 精子與HeLa細(xì)胞融合形成的嵌合細(xì)胞的分離和鑒定

利用顯微注射系統(tǒng)抓取和單克隆培養(yǎng)的方法，我們目前共獲得4個(gè)精子與HeLa細(xì)胞融合單克隆株。經(jīng)小鼠Y染色體特異編碼的性別決定基因(S RY ) 和GAPDH的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中的2個(gè)單克隆株為含有小鼠X染色體的嵌合細(xì)胞(GAPDH擴(kuò)增陽(yáng)性而SRY擴(kuò)增陰性，稱為X型單克隆，圖4A)，2個(gè)單克隆株為含有小鼠Y染色體的嵌合細(xì)胞(GAPDH和SRY雙陽(yáng)性，稱為Y型單克隆，圖4B)。

2.5 臨床宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細(xì)胞的篩檢和鑒定

通過(guò)對(duì)20例臨床宮頸癌病理組織切片的PCR分析，我們?cè)谄渲幸焕?5%，1/20)發(fā)現(xiàn) TSPY基因擴(kuò)增陽(yáng)性(圖5A)。此外，我們?cè)?TSPY基因的擴(kuò)增片段中發(fā)現(xiàn)1處有義突變[天門(mén)冬氨酸(GAC)突變?yōu)榻M氨酸(CAC)，圖5B]。

圖4 精子與HeLa嵌合細(xì)胞的鑒定

3 討論

精子與除卵細(xì)胞外的其他細(xì)胞的融合是一種奇特的生物學(xué)現(xiàn)象。我們推測(cè)相對(duì)于體細(xì)胞，精子可能更容易與腫瘤細(xì)胞發(fā)生融合，因?yàn)椋孩僖恍┡R床研究發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于周邊的正常組織，女性肺腺癌[10]和甲狀腺癌[11]組織中存在更高比例的嵌合細(xì)胞；②腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)有很大差別，這主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜糖蛋白、糖脂、黏蛋白及膽固醇水平變化、結(jié)構(gòu)異常及特殊修飾(如糖基化)程度的改變，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜荷電量顯著升高，細(xì)胞間接觸抑制消失；細(xì)胞膜流動(dòng)性及通透性升高以及細(xì)胞表面蛋白水解酶濃度升高等[12-15]；③整合素(integrin)和受精素的相互識(shí)別和作用是精卵細(xì)胞膜相互融合的必要條件，而多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)整合素，整合素能夠激發(fā)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，從而改變細(xì)胞膜局部細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性，介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[16]。

圖5 宮頸癌組織中 TSPY基因的擴(kuò)增和測(cè)序

我們前期的研究結(jié)果建立了穩(wěn)定的精子與腫瘤細(xì)胞體外融合模型，并證實(shí)了精子在體外可以與腫瘤細(xì)胞相互融合[9]。在本項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)：精子與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的前1.5h， 殘存的貼壁腫瘤細(xì)胞數(shù)急劇下降，此后殘存的貼壁腫瘤細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)顯著變化(圖1)。鑒于嵌合型腫瘤細(xì)胞離壁漂浮生長(zhǎng)的特性，故可以認(rèn)為精子與腫瘤細(xì)胞的融合事件大多發(fā)生于共培養(yǎng)的1.5 h內(nèi)。而且精子與腫瘤細(xì)胞的融合率在很大程度上取決于腫瘤細(xì)胞的接種密度，隨著細(xì)胞接種密度的升高，精子與腫瘤細(xì)胞的融合率呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)。我們認(rèn)為這可能是因?yàn)檩^低的細(xì)胞密度增大了精子與腫瘤細(xì)胞膜的接觸面積，使更多的精子有可能與腫瘤細(xì)胞膜相接觸，從而增大了精子與腫瘤細(xì)胞融合的可能性[17]。更為重要的是我們的研究發(fā)現(xiàn)：精子與腺癌來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的融合率顯著高于其他類(lèi)型腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞(圖3)，這一研究結(jié)果與先前所報(bào)道的女性腺癌組織[9-10]相對(duì)于周邊正常組織 有 較高的嵌合細(xì)胞比例相一致，而體外發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在國(guó)際上尚屬首次。

利用顯微操作及單克隆培養(yǎng)的方法我們獲得了4個(gè)精子與HeLa細(xì)胞融合所形成的嵌合型單克隆細(xì)胞株，并進(jìn)行了生物學(xué)鑒定(圖4)。雖然以目前的研究方法我們尚不能確定嵌合型HeLa是由單個(gè)或者多個(gè)精子嵌合而成，但我們較為關(guān)注的是Y染色體編碼的基因，尤其是具有原癌或者抑癌基因性質(zhì)的基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，從這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，我們獲得的單克隆株足以勝任嵌合型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究。

雖然我們體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了精子與腫瘤細(xì)胞融合的可能性，但體內(nèi)的實(shí)際情況往往更加復(fù)雜，那么在體內(nèi)精子是否也可以和腫瘤細(xì)胞發(fā)生融合呢？我們的研究結(jié)果給出了肯定的答案。我們以20例宮頸癌蠟塊標(biāo)本為研究對(duì)象，體外擴(kuò)增Y染色體特異編碼的 TSPY基因，結(jié)果在1例標(biāo)本中得到了陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，提示宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細(xì)胞的存在?？紤]到嵌合型腫瘤細(xì)胞只是腫瘤組織的一小部分，而我們的標(biāo)本只是取自于一個(gè)蠟塊標(biāo)本，而且我們檢測(cè)的只是含有Y染色體的嵌合細(xì)胞，含有X染色體的嵌合細(xì)胞的情況以目前的實(shí)驗(yàn)手段尚不能檢出，因此，實(shí)際宮頸癌組織中嵌合細(xì)胞的比例應(yīng)該遠(yuǎn)高于本次實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)。此外我們發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的宮頸癌組織中的 TSPY基因存在1處有義突變，該突變的發(fā)生是否會(huì)導(dǎo)致 TSPY這一具有原癌基因性質(zhì)的基因表達(dá)蛋白量或者結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的惡化尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

結(jié)合我們前期 的 研究結(jié)果，我們以多種方式證實(shí)了精子與腫瘤細(xì)胞融合的可能性。而且我們證實(shí)：精子與腫瘤細(xì)胞的體外融合通常發(fā)生于共培養(yǎng)的1.5h內(nèi)，較低的接種密度更有利于精子與腫瘤細(xì)胞的融合，而且腺癌來(lái)源的腫瘤細(xì)胞更容易與精子發(fā)生融合。

我們的體內(nèi)研究提示精子有與宮頸癌細(xì)胞融合而形成嵌合型腫瘤細(xì)胞的可能，那么，這種新形成的腫瘤細(xì)胞將具有怎樣特殊的、不同于融合前腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)？根據(jù)嵌合型體細(xì)胞所表現(xiàn)出的干細(xì)胞樣特征和較高的遷移能力，我們推測(cè)嵌合型腫瘤細(xì)胞應(yīng)該具有除惡性表型外的干細(xì)胞樣特征和較高的遷移能力，即腫瘤干細(xì)胞樣特征和更高的轉(zhuǎn)移能力。如果這樣，無(wú)回避措施的性生活將成為宮頸癌患者病情進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。因此，嵌合型腫瘤細(xì)胞單克隆株生物學(xué)特性的研究將為宮頸癌患者能否進(jìn)行無(wú)回避措施的性生活提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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