馬浩然，賈海蓮，張文龍，王 晶，張男男，李可欣，邰大鵬，戈 娜,*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院 營養(yǎng)與食品健康研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

酒精性肝損傷又稱酒精性肝病，是指長期大量飲酒所致的肝損傷，也是導(dǎo)致肝癌甚至急性肝衰竭最常見的誘因之一[1]。在臨床上常見酒精性肝病患者會伴有內(nèi)毒素血癥的出現(xiàn)，而越來越多的研究也顯示，酒精能夠引起肝細(xì)胞損傷、腸道菌群改變、腸道上皮細(xì)胞屏障功能障礙、腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物易位和內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，揭示出腸道菌群在酒精誘導(dǎo)的肝損傷中扮演著重要的角色[2-4]。熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸、烏蘇酸、香樹脂醇，是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物，分子式為C30H48O3，在自然界分布廣范，多以游離或與糖結(jié)合成苷的形式存在于沙棘、女貞子、山楂、蔓越莓、枇杷葉等植物中，是多種植物的主要功能成分[5]。目前研究已發(fā)現(xiàn)UA不僅具有抗炎、抑菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)，而且具有活性強(qiáng)、安全性高、毒性低（口服半數(shù)致死量為8 330 mg/kg）等特性[6-8]。Saravanan等[9]的研究還發(fā)現(xiàn)，UA對酒精性肝損傷有保護(hù)作用，但機(jī)制不明。已有文獻(xiàn)報道酒精性肝損傷常伴有腸道菌群失調(diào)癥狀[10-11]，且該類患者常出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。本研究以腸道菌群為著眼點，探討UA對酒精性肝損傷的保護(hù)機(jī)制。調(diào)節(jié)腸道菌群可以防止革蘭氏陰性菌的過量繁殖，進(jìn)而避免內(nèi)毒素水平過高對肝臟進(jìn)行的“二次傷害”[5]。本研究應(yīng)用基因間重復(fù)共有序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）指紋圖譜分析以及實時熒光PCR技術(shù)等方法，探討UA對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響，以期為后續(xù)UA對酒精性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究提供可參考的依據(jù)，同時也為酒精性肝損傷的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

2 月齡雄性Wistar大鼠，SPF級，30 只，體質(zhì)量180～200 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物合格證號：SCXK（魯）20140001。

UA（純度98%） 長沙麓園生物科技有限公司；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒南京建成生物工程研究所；內(nèi)毒素檢測顯色基質(zhì)鱟試劑盒廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海迪奧生物科技有限公司；糞便總DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通PCR試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物 上海英俊公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株 廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心；定量PCR試劑盒 大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ELx808型酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；PCR儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀、微量紫外分光光度計 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及樣本采集

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d之后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成3 組，每組10 只，分別為正常對照組、酒精模型組、UA干預(yù)組。正常對照組每日給予生理鹽水灌胃1 次，持續(xù)8 周；酒精模型組給予體積分?jǐn)?shù)50%酒精8 mL/（kg·d）灌胃2 周，第3周把酒精劑量提高至12 mL/（kg·d），持續(xù)灌胃6 周；UA干預(yù)組每日給予150 mg/（kg·d） UA，1 h后再給予酒精灌胃，劑量同模型組。各組大鼠自由進(jìn)食和飲水，實驗持續(xù)8 周。末次灌胃12 h后，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔麻醉，腹主動脈取血。剝離肝臟組織，一部分用于病理學(xué)分析，剩余部分肝臟-80 ℃凍存?zhèn)溆?。此外，用無菌棉簽從結(jié)腸留取新鮮糞便3～5 g充滿無菌標(biāo)本盒，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測指標(biāo)

1.3.2.1 肝臟組織HE染色觀察

新鮮大葉肝相同部位組織1 塊（約0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm），體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛緩沖液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶活力檢測

采用賴氏法檢測各組大鼠血清ALT和AST活力，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2.3 大鼠血漿中D-LA濃度和內(nèi)毒素水平檢測

采用ELISA法檢測血漿D-LA濃度，顯色基質(zhì)鱟試劑盒檢測血漿內(nèi)毒素水平，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2.4 糞便腸道菌群基因組總DNA提取

稱取180 mg糞便樣品，采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取腸道菌群基因組總DNA，提取過程嚴(yán)格按照說明書操作。使用微量分光光度計和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量濃度和純度。

1.3.2.5 ERIC-PCR檢測

以腸道菌群基因組DNA為模板進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增。采用的通用引物序列為：上游引物：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’；下游引物：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’。采用5×TBE緩沖液制備1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，90 V電泳40 min。通過凝膠成像分析系統(tǒng)對DNA條帶進(jìn)行拍照并分析結(jié)果，尋找各組樣品間的規(guī)律性變化，做出對腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的分析。

1.3.2.6 PCR-DGGE檢測

對腸道菌群總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)擴(kuò)增，采用的通用引物序列為：V3F+GC：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA C-3’，V3R+GC：3’-GGG GGC CTA CGG GAG GCA GCA G-5’，目的基因片段長度220 bp。使用DGGE凝膠制備裝置，40%～50%變性梯度膠，60 ℃恒溫點樣，100 V電泳300 min。應(yīng)用Quantity One進(jìn)行非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。

1.3.2.7 實時熒光定量PCR檢測

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒提取4 種細(xì)菌DNA，并進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行割膠回收，使用微量紫外分光光度計測定質(zhì)量濃度計算拷貝數(shù)，制成102～109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品（100 ng/μL）一同使用96 孔板上樣。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2＞0.999）生成的公式以及機(jī)器測量的Ct值計算樣品拷貝數(shù)，各組之間進(jìn)行比較。各菌目的片段長度以及退火溫度見表1。

表1 PCR引物信息和預(yù)期產(chǎn)物長度Table 1 Information on primers used in PCR and expected product length

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。對符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料多組間比較，采用單因素方差分析，以表示，不同組間兩兩比較采用最小顯著性差異法-t檢驗；非正態(tài)或方差不齊的計量資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，以M（P25，P75）表示，不同組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UA干預(yù)對酒精暴露大鼠肝臟組織病理學(xué)改變的影響

圖1 HE染色觀察大鼠肝臟組織的病理學(xué)改變（400×）Fig. 1 Pathological observation of liver tissue by HE staining in rats (400 ×)

如圖1所示，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板排列整齊，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列（圖1A）；酒精模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞大片性壞死，胞質(zhì)中可見大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，壞死區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤（圖1B）。而UA干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)雖有不同程度破壞，但與酒精模型組相比較，肝索排列逐漸恢復(fù)整齊（圖1C）。

2.2 UA干預(yù)對酒精誘導(dǎo)肝損傷大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響

表2 UA對酒精性肝損傷大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響Table 2 Effects of UA on serum aminotransferase level in alcohol-treated rats

如表2所示，酒精模型組血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），而UA干預(yù)組較酒精模型組ALT和AST活力均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 UA對酒精性肝損傷大鼠血漿中D-LA濃度和內(nèi)毒素水平的影響

表3 UA對酒精性肝損傷大鼠血漿D-LA濃度和內(nèi)毒素水平的影響Table 3 Changes in plasma D-LA and endotoxin in rats from different groups

由表3可知，大鼠給予50%酒精連續(xù)灌胃8 周后，酒精模型組大鼠血漿D-LA濃度和內(nèi)毒素水平顯著高于正常對照組（P＜0.05），分別為正常對照組的1.6、1.5 倍；而UA干預(yù)后可明顯抑制酒精所致的血漿D-LA濃度和內(nèi)毒素水平的升高（P＜0.05）。

2.4 大鼠腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析

圖2 大鼠糞便腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析Fig. 2 ERIC-PCR fingerprint of gut microbes in rats from different groups

如圖2所示，酒精模型組大鼠腸道菌群明顯區(qū)別于空白對照組大鼠，在1 000 bp左右有清晰明亮的條帶1，而UA干預(yù)組該條帶則較暗，接近正常水平；約在250 bp處空白組較酒精模型組有較亮的條帶2，UA干預(yù)組該條帶亮度介于二者之間。

2.5 大鼠糞便總DNA PCR-DGGE指紋圖譜分析

圖3 糞便微生物總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Gel electrophoresis of PCR products of V3 variable region of 16S rDNA gene sequence from total genomic DNA in gut microbes

圖4 DGGE圖譜中腸道菌群的變化（A）以及UPGMA聚類分析（B）Fig. 4 Changes in gut microbes by DGGE (A) and UPGMA cluster analysis (B) in two groups

如圖3所示，對各組大鼠糞便微生物總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及1%的瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物長度為220 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE得到指紋圖譜，進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖4），可見酒精模型組與其他兩組相似系數(shù)僅為0.21，UA干預(yù)組與正常對照組相似系數(shù)為0.46。酒精模型組大鼠腸道菌群多樣性明顯下降且與正常組的相似性較低，而UA干預(yù)組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常組大鼠更相似。

2.6 糞便中特定菌株的定量分析

表4 UA對酒精暴露大鼠腸道菌群特定菌株的定量分析（M（P25，P75），n＝10）Table 4 Quantities of gut microbes in rats from different groups(M(P25, P75), n= 10)拷貝/μL

如表4所示，與正常對照組比較，酒精模型組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量均明顯增多（P＜0.05）；而UA干預(yù)組大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量較酒精模型組顯著減少（P＜0.05），且與正常對照組大鼠間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。此外，酒精模型組大鼠糞便中長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數(shù)量與正常對照組相比均顯著降低（P＜0.05），而UA干預(yù)后可以明顯抑制這種變化，使兩種腸道菌群更趨近于正常對照組。

3 討 論

腸道菌群指腸道正常微生物群，它們按照一定規(guī)律分布在腸道內(nèi)，與腸黏膜共同形成防御屏障[12]?，F(xiàn)有研究表明，長期過量飲酒可使腸道微生物群組成和分布發(fā)生紊亂，腸道內(nèi)有益菌數(shù)量減少，有害菌繁殖增多，進(jìn)而引起內(nèi)毒素大量分泌，破壞腸黏膜滲透入血，誘發(fā)內(nèi)毒素血癥，最終導(dǎo)致肝臟損傷[4,11]。

肝臟病理學(xué)檢查是反映肝損傷程度最直觀的證據(jù)，也是臨床常用的金標(biāo)準(zhǔn)。ALT與AST活力是檢測肝臟損傷的最敏感指標(biāo)，可以在一定的范圍內(nèi)反映生物體內(nèi)肝細(xì)胞的損傷程度大小。各種急性病毒性肝炎、藥物或酒精引起急性肝細(xì)胞損傷時，血清ALT活力最敏感，在臨床癥狀如黃疸出現(xiàn)之前ALT活力就急劇升高，同時AST活力也升高[13]。本研究結(jié)果顯示，UA干預(yù)能夠改善肝臟組織病理學(xué)改變，同時有效抑制大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的釋放，從而對酒精誘導(dǎo)的肝損傷起到保護(hù)作用，這與Caignin等[6]的報道一致。D-LA是腸道多種細(xì)菌發(fā)酵的終代謝產(chǎn)物。正常情況下血清D-LA在人體內(nèi)含量很低，但當(dāng)腸道通透性的增加時，可導(dǎo)致D-LA涌入血液循環(huán)[14]。因此，D-LA常被認(rèn)為是腸道通透性增加的敏感性指標(biāo)之一[15-16]。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的一種脂多糖和微量蛋白質(zhì)的復(fù)合物。酒精除了能夠直接激活toll樣受體（toll-like receptor，TLR）信號通路引起肝損傷，還能夠增加變形菌及革蘭氏陰性菌的數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)毒素產(chǎn)量增高。過量的內(nèi)毒素破壞腸黏膜入血，通過門靜脈進(jìn)入肝臟，與肝細(xì)胞上的TLR4結(jié)合，啟動一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成肝損傷[17]。臨床上發(fā)現(xiàn)重癥的酒精性肝炎會常常伴有內(nèi)毒素血癥，Parlesak等[18]發(fā)現(xiàn)酒精肝病患者血液中內(nèi)毒素水平是正常人的5 倍。本實驗通過對D-LA和內(nèi)毒素檢測結(jié)果的分析可知：酒精模型組大鼠血中D-LA濃度和內(nèi)毒素水平均顯著升高，經(jīng)過8 周UA干預(yù)后，這種升高明顯得到抑制，提示長期大劑量酒精攝入可能導(dǎo)致大鼠腸道內(nèi)微生態(tài)失衡，腸黏膜受損，腸通透性增加，進(jìn)而誘發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，最終導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生或加重；而UA的補(bǔ)充可改善腸黏膜屏障，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和釋放，從而有效緩解肝臟損傷。

近年來的研究已發(fā)現(xiàn)酒精可引起腸道菌群的失衡，因此越來越多的人開始關(guān)注酒精性肝損傷的發(fā)生與腸道菌群失衡的關(guān)系[19-21]。本研究通過3 組間的對比進(jìn)行酒精性肝損傷大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，以往對腸道菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識常采用傳統(tǒng)生物培養(yǎng)技術(shù)，但因腸道內(nèi)約90%的微生物不能在體外培養(yǎng)，因此不能客觀評價腸道微生物群落的變化規(guī)律[22]。ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)是目前被廣泛用于腸道結(jié)構(gòu)及種群變化的分子生物學(xué)方法，其靈敏度和可靠性較好，且能克服傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)費(fèi)時、費(fèi)力及培養(yǎng)過程中菌種比例發(fā)生變化等缺點[23-25]。本實驗通過對3 組大鼠腸道菌群基因ERIC-PCR指紋圖譜觀察可見酒精性肝損傷大鼠的腸道菌群明顯區(qū)別于健康大鼠，而UA干預(yù)后的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)更加接近于正常對照組。PCR-DGGE結(jié)果顯示酒精使腸道菌群種類及數(shù)量發(fā)生明顯變化，多樣性降低，且與其他兩組相似度較低；而UA干預(yù)組與空白對照組相似度較高，更加直觀的表明UA補(bǔ)充對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。16S rDNA為編碼16S rRNA的基因，存在于所有細(xì)菌染色體基因組中，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的“分子鐘”，其種類少、含量大（約占細(xì)菌DNA含量的80%）、分子大小適中，可變區(qū)因細(xì)菌而異，變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。因此，16S rDNA是細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子[22,26-28]。本研究采用16S rDNA實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測酒精暴露大鼠糞便中4 種具有代表性的細(xì)菌，包括大腸桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌[29]。結(jié)果顯示：酒精攝入后隸屬革蘭氏陰性桿菌的大腸桿菌與糞腸球菌數(shù)量顯著升高，放線菌門的長雙歧桿菌和厚壁菌門的嗜酸乳酸桿菌數(shù)量顯著下降，這一結(jié)果與Bull-Otterson等[30]的研究結(jié)果相似，說明酒精可以引起腸道菌群的失衡；但UA干預(yù)后可見大鼠糞便中大腸桿菌數(shù)量明顯下降（P＜0.05），而長雙歧桿菌與嗜酸乳酸桿菌數(shù)量顯著回升（P＜0.05），與酒精模型組形成鮮明對比。上述結(jié)果均提示UA可調(diào)節(jié)腸道菌群，防止腸道內(nèi)菌群失衡，進(jìn)而發(fā)揮改善酒精性肝損傷的作用。

綜上所述，長期大劑量酒精攝入可能導(dǎo)致腸道黏膜通透性增大，大鼠腸道內(nèi)微生態(tài)失衡，加速內(nèi)毒素釋放，最終加重肝細(xì)胞損傷；補(bǔ)充UA可能通過調(diào)節(jié)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，修復(fù)腸黏膜細(xì)胞屏障，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和釋放，改善腸道微生態(tài)，從而達(dá)到有效緩解肝細(xì)胞損傷的功效。

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