劉國英 郝鵬 陳光達(dá) 李志鵬/金宇保靈生物藥品有限公司

偽狂犬病毒（Pesudorabies virus，PRV）屬于皰疹Ⅰ型病毒，PRV病毒粒子的核衣殼成正二十面體，帶囊膜的成熟病毒粒子直徑約120～300nm。自2011年以來，我國多地豬場暴發(fā)偽狂犬病，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大影響。目前，急需生產(chǎn)出高質(zhì)量偽狂犬疫苗來應(yīng)對疫情的威脅。傳統(tǒng)的偽狂犬疫苗單位體積內(nèi)抗原含量不高，免疫效果不佳；雜蛋白含量較多，免疫副反應(yīng)較嚴(yán)重。本實驗通過中空纖維純化濃縮系統(tǒng)有效提高了每頭份疫苗的抗原含量，降低了雜蛋白和內(nèi)毒素含量，提升了疫苗品質(zhì)。

一、材料和方法

1.PRV種毒、主要試劑和儀器。PRV種毒（Bartha K61株）由本公司保存并提供，500 KD中空纖維柱購自GE公司。

2.實驗方案。（1）偽狂犬病毒原液離心。將懸浮培養(yǎng)收獲的偽狂犬病毒原液離心，棄去細(xì)胞碎片等沉淀，取上清液備用。（2）偽狂犬毒液濃縮及洗濾。將離心后病毒上清液400L通過500 KDa中空纖維系統(tǒng)進(jìn)行切向流過濾濃縮，濃縮倍數(shù)到5倍時，使用PBS溶液洗濾。洗濾結(jié)束后，最終體積達(dá)到40L，達(dá)到10倍濃縮效果。

3.病毒滴度的測定。取原液樣、離心后樣、濃縮后樣品分別接種于鋪滿單層BHK細(xì)胞的96孔細(xì)胞板，每個稀釋度接種8個孔，每孔100μl，置于在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)3～5日，根據(jù)Reed-Muench法計算每個樣品的TCID50。

二、結(jié)果

1.雜蛋白去除率檢測結(jié)果。雜蛋白去除率檢測結(jié)果如表1所示，三批疫苗樣品純化濃縮后單位體積內(nèi)雜蛋白含量雖然有所增加，但是總雜蛋白去除率分別達(dá)到了89.85%、89.82%、89.93%。

表1 蛋白含量檢測結(jié)果

2.病毒滴度測定結(jié)果。三批疫苗樣品純化濃縮前后病毒滴度測定結(jié)果如表2所示。

批次 濃縮倍數(shù)原液樣品TCID50/ml離心后樣品TCID50/ml濃縮后樣品TCID50/ml 1 10倍 8.00 7.75 8.75 2 10倍 8.25 8.25 9.13 3 10倍 7.75 7.50 8.63

三、討論

本實驗使用中空纖維純化濃縮系統(tǒng)對三批偽狂犬病毒液進(jìn)行10倍濃縮，純化濃縮后的疫苗單位體積內(nèi)抗原含量顯著增加，雜蛋白含量顯著降低。通過純化濃縮有效的解決由于抗原含量低導(dǎo)致的抗體效價低和雜蛋白含量高導(dǎo)致副反應(yīng)嚴(yán)重的問題。

三批偽狂犬病毒液雖然離心后有部分損失，但10倍純化濃縮后，病毒滴度基本相應(yīng)的增加了10倍。濃縮后單位體積內(nèi)蛋白含量略有增加，但是總雜蛋白除去90%左右，配苗稀釋后每頭份疫苗中雜蛋白含量極低。

除了傳統(tǒng)的純化濃縮方法外，近些年出現(xiàn)的層析法純化濃縮系統(tǒng)、GEM純化濃縮技術(shù)等，成本高昂，技術(shù)不夠成熟不適合工業(yè)化生產(chǎn)等缺點。目前中空纖維純化濃縮系統(tǒng)在工業(yè)化生產(chǎn)中運(yùn)用廣泛，技術(shù)成熟。

參考文獻(xiàn)（略）