王敏娟，李貝，李莉，謝萍，張川，展玉濤(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京0003；首都醫(yī)科大學(xué))

肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)發(fā)病原因十分復(fù)雜，多種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾在肝癌的發(fā)病過程中具有重要意義[1]。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾主要包括泛素化、磷酸化和乙?；痆2～4]。泛素化是肝癌發(fā)病一些關(guān)鍵蛋白的重要轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)的泛素化由泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素蛋白連接酶(E3)共同參與完成[3]，其中E3決定泛素底物的特異性[5,6]，主要包括RING類和HECT類兩大家族[7]。泛素連接酶Smad泛素化相關(guān)因子1(Smurf1)屬于HECT類E3[8,9]，目前關(guān)于Smurf1在肝癌發(fā)生中的作用研究較少。為此，我們于2017年2～7月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級雄性Wistar大鼠35只，4周齡，體質(zhì)量(120±10)g，均購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部。主要試劑：抗Smurf1抗體購自美國Abcam公司，抗β-actin抗體和相關(guān)二抗均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，二乙基亞硝胺(DEN，純度>99%)購自美國Sigma公司，10%多聚甲醛購自谷歌生物科技有限公司。

1.2 動物分組與肝癌模型建立 將35只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為模型組25只和對照組10只，所有大鼠在SPF級動物房中常規(guī)飼料喂養(yǎng)。模型組按照體質(zhì)量給予0.2 mL/100 g DEN溶液(0.25 mL DEN+10 mL生理鹽水)腹腔注射，2次/周；對照組按照體質(zhì)量給予0.2 mL/100 g生理鹽水腹腔注射，2次/周。連續(xù)注射15周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量與肝臟大體情況 兩組連續(xù)注射15周，稱取體質(zhì)量。10%水合氯醛麻醉后開腹，取肝組織，觀察其大體情況；稱取肝臟質(zhì)量，計算肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量。將一部分肝臟組織用10%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)進(jìn)行修塊、脫水、二甲苯透明、石蠟浸泡、石蠟包埋及切片，剩余肝臟組織保存于液氮中。

1.3.2 肝臟組織病理情況 采用HE染色。取1.3.1中制備的肝臟組織切片，依次進(jìn)行烤片、脫蠟、蘇木素-伊紅染色、二甲苯透明及中性樹脂封片。于40倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理情況。

1.3.3 肝臟組織Smurf1表達(dá) ①采用免疫組化法。取1.3.1中制備的肝臟組織切片，經(jīng)過烤片、切片復(fù)水、PBS沖洗3次；加入3% H2O2封閉過氧化物，置于濕盒壁光保存15 min、PBS沖洗3 min×3次，抗原修復(fù)后PBS沖洗3 min×3次；以羊血清封閉，加入Smurf1抗體，4 ℃孵育過夜、PBS沖洗3 min×3次；加入Smurf1二抗，37 ℃放置30 min，PBS沖洗3 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色混勻，顯色2 min后鏡下觀察，蒸餾水沖洗5 min×2次，蘇木素染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。于40倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，以肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色呈棕黃色定義為陽性染色。采用IPP軟件分析兩組肝臟組織染色的光密度值，取平均值，以此表示肝臟組織Smurf1陽性表達(dá)情況。②采用Western blotting法。取1.3.1中液氮保存的肝臟組織30 mg，置于EP管中；加入300 μL RIPA組織裂解液，組織勻漿儀勻漿，13 000 r/min離心10 min；取100 μL上清加入同體積2×上樣緩沖液(Loading buffer)，100 ℃水浴鍋煮15 min，3 000 r/min離心5 min。按照4 μL/孔上樣，SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗Smurf1和β-actin抗體(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。0.1% PBST洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜，加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑于暗室壓片。采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值計算Smurf1相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

連續(xù)用藥15周，模型組15只死亡，對照組無死亡。

2.1 兩組體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量比較 模型組體質(zhì)量及肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量低于對照組，肝臟質(zhì)量高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 肝臟大體情況 模型組肝臟顏色為棕黃色，肝臟體積明顯增大，被膜下可見大量粟粒樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地變硬，肝緣變鈍。對照組肝臟顏色為棕紅色，被膜光滑，質(zhì)地柔軟。

2.3 肝臟組織病理情況 模型組肝臟細(xì)胞排列成小梁狀，間質(zhì)由襯覆單層內(nèi)皮細(xì)胞的血竇樣腔隙組成，細(xì)胞核大小不一，核膜增厚，可見核仁，核質(zhì)比增高。對照組肝組織以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝索排列規(guī)整。

2.4 兩組肝臟組織Smurf1表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，模型組與對照組肝臟組織Smurf1光密度值分別為0.405 5±0.001 7、0.287 6±0.002 4，兩組比較P<0.01。Western blotting結(jié)果顯示，模型組與對照組肝臟組織Smurf1蛋白相對表達(dá)量分別為7 472±554、1 853±499，兩組比較P<0.01。

3 討論

肝癌動物模型是研究肝癌發(fā)病機(jī)制與防治手段的重要方法。目前，建立肝癌動物模型的方法主要包括誘發(fā)性肝癌動物模型、自發(fā)性肝癌動物模型、移植性肝癌動物模型和轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型，其中以化學(xué)藥物誘發(fā)的動物模型較為常用，常用于誘發(fā)動物肝癌模型的化學(xué)藥物有DEN、四氯化碳(CCl4)及黃曲霉素(AFB)等。DEN誘發(fā)大鼠肝癌所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和肝臟損傷程度與人體肝癌的發(fā)病過程相似，是一種公認(rèn)的誘導(dǎo)肝癌藥物。研究表明，50 mg/kg的DEN既能提高大鼠成癌率，又能明顯縮短成癌時間[10～12]。腹腔注射方法簡單，成功率高。在動物選擇方面，Wistar大鼠比小鼠個體差異小、敏感性高，成癌效果更穩(wěn)定，且雄性大鼠較雌性大鼠更易誘發(fā)肝癌，有研究表明Wistar雄性大鼠是目前實驗研究肝癌的最常用動物模型[13]。本研究以雄性Wistar大鼠為研究對象，采用腹腔注射0.2 mL/100 g(相當(dāng)于人體50 mg/kg)DEN溶液的方法建立大鼠肝癌模型。結(jié)果表明模型組肝臟呈棕黃色，肝臟體積增大，質(zhì)地變硬，被膜下可見大量結(jié)節(jié)，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不一，核質(zhì)比增高，核膜增厚；而對照組肝臟呈棕紅色，質(zhì)地柔軟，肝緣銳利，肝細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，肝條索排列規(guī)整。以上均證明成功建立大鼠肝癌模型。

Smurf1是HECT類E3的典型代表，最早被發(fā)現(xiàn)是Smad1/5的泛素調(diào)節(jié)因子[14,15]，后來發(fā)現(xiàn)其能降解 Smad1、Smad5、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和有絲分裂原活化蛋白激酶2(MEKK2)等成骨細(xì)胞活性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，從而負(fù)性調(diào)控骨形成[16～18]。Smurf1通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種信號途徑和關(guān)鍵蛋白等參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Smurf1可能通過降解小G蛋白RhoA[14,19,20]和Wnt信號蛋白[21,22]而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移。Smurf1通過促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4(TRAF4)的泛素化降解，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19,23]。Smurf1能負(fù)調(diào)控doc2/DAB2互動蛋白(DAB2IP)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[24]。本研究免疫組化和Western blotting結(jié)果均顯示，模型組肝臟組織Smurf1蛋白表達(dá)明顯高于對照組。說明Smurf1在肝癌大鼠肝臟組織中的表達(dá)升高，Smurf1可能參與了肝癌的發(fā)病過程，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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