黃宏興，柴爽，黃紅，萬(wàn)雷，王吉利(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣州5040；廣州中醫(yī)藥大學(xué))

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。近年來(lái)越來(lái)越多的研究認(rèn)為，成骨細(xì)胞凋亡及其功能異常在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病中具有重要作用[1～5]。細(xì)胞凋亡途徑主要包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑，內(nèi)源性途徑主要通過(guò)Bcl2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，其中Bcl2屬于抗凋亡蛋白、Bak1屬于促凋亡蛋白[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者椎板旁骨骼肌線粒體通透轉(zhuǎn)換孔活性增強(qiáng)、股骨粗隆間部松質(zhì)骨Bak1表達(dá)明顯升高，Bcl2表達(dá)則明顯降低[7]。成骨細(xì)胞具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機(jī)成分，對(duì)骨生長(zhǎng)有重要作用。研究表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者以及脊髓損傷后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型來(lái)源的成骨細(xì)胞活力均下降[8]。2017年3～6月，本研究采用腺病毒介導(dǎo)Bcl2、Bak1 shRNA單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染成骨肉瘤MG-63細(xì)胞，并觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及成骨功能的影響，以期為進(jìn)一步研究成骨細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松癥中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：MG-63細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供。重組腺病毒載體：參照本課題組前期研究設(shè)計(jì)并篩選出沉默效率最高的Bcl2、Bak1 shRNA，并分別構(gòu)建重組腺病毒載體。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Pen/Strep購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)抗體、抗骨橋蛋白(OPN)抗體、抗Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)抗體、抗TNF-α抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自法國(guó)NaPCO公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、Mini-Trans Blot蛋白轉(zhuǎn)印儀、ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，制成密度為1×104/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為shBcl2組、shBak1組、共轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。shBcl2組、shBak1組、空白對(duì)照組分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染shBcl2、shBak1重組腺病毒和空載腺病毒，感染復(fù)數(shù)(MOI)=50，共轉(zhuǎn)染組采用同樣的方法共轉(zhuǎn)染shBcl2、shBak1重組腺病毒。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 細(xì)胞增殖能力 采用MTT法。取1.2中轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO，室溫?fù)u床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)孔/A正常對(duì)照孔×100%。

1.3.2 ALP活性 采用對(duì)硝基苯磷酸鹽法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理。各組轉(zhuǎn)染48 h后棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量。按照ALP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀上測(cè)定405 nm或400～415 nm波長(zhǎng)處的A值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的A值×稀釋倍數(shù)(2.5)/蛋白濃度(μg/μL)計(jì)算ALP活性。

1.3.3 成骨相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。各組轉(zhuǎn)染48 h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，向細(xì)胞沉淀中加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液，置于冰上并用槍頭吹打，使細(xì)胞充分裂解30 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷EP管中，- 20 ℃保存?zhèn)溆?。BSA法測(cè)定總蛋白含量，計(jì)算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，在蛋白標(biāo)本中加入適當(dāng)體積的蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，分別加入BMP4、OPN、Runx2、TNF-α一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST室溫下脫色搖床上洗3次(每次5 min)，加入二抗(1∶3 000)，室溫下孵育30 min。ECL法顯色，圖像處理軟件分析各條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率、ALP活性比較 shBcl2組細(xì)胞增殖率、ALP活性均低于空白對(duì)照組，shBak1組細(xì)胞增殖率、ALP活性均高于空白對(duì)照組(P均<0.01)?？瞻讓?duì)照組與共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率、ALP活性比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率、ALP活性比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與shBcl2組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與shBak1組比較，△P<0.01。

2.2 各組成骨相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 shBcl2組細(xì)胞BMP4、OPN、Runx2相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組，TNF-α相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P均<0.05)。shBak1組細(xì)胞BMP4、OPN、Runx2相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，TNF-α相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P均<0.01)?？瞻讓?duì)照組與共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BMP4、OPN、Runx2、TNF-α相對(duì)表達(dá)量比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組成骨相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01，#P<0.05；與shBcl2組比較，▲P<0.01；與shBak1組比較，△P<0.01。

3 討論

Bcl2家族蛋白根據(jù)所含功能域的不同可分為三大類：抗凋亡亞家族(Bcl2、Bcl-XL、Mcl-1等)，促凋亡亞家族(Bax、Bak)和僅含BH3結(jié)構(gòu)域的BH3-only亞家族(Bid、Bad、Bim等)，家族成員之間可形成同源二聚體和異源二聚體，其中抗凋亡與促凋亡成員之間形成的異源二聚體可抑制促凋亡蛋白的生物活性[9]，它們之間的平衡決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性[10]。早期研究多認(rèn)為，Bax對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL具有較強(qiáng)親和力，而B(niǎo)ak1對(duì)抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-XL具有較強(qiáng)的親和力[11,12]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Bak1蛋白與Bcl2的結(jié)合比其與Bcl-XL的結(jié)合更緊密，而且Bcl2下調(diào)能誘導(dǎo)Bak依賴性細(xì)胞凋亡[13]。在凋亡刺激誘導(dǎo)下，BH3-only亞家族蛋白被激活并轉(zhuǎn)移到線粒體上，與抗凋亡蛋白(Bcl2、Bcl-XL)結(jié)合，釋放促凋亡蛋白(Bax、Bak)，或直接激活促凋亡蛋白(Bax、Bak)，在線粒體上形成蛋白孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體中釋放而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

為進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡對(duì)骨形成的影響，本課題組設(shè)計(jì)并篩選出具備最佳沉默效率的Bcl2、Bak1 shRNA，構(gòu)建重組腺病毒載體。本研究采用shBcl2、shBak1重組腺病毒載體單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)shBcl2組細(xì)胞增殖率、成骨細(xì)胞的早期分化標(biāo)志ALP活性均低于空白對(duì)照組；shBak1組細(xì)胞增殖率、ALP活性均高于空白對(duì)照組；這可能與RNA干擾使Bcl2表達(dá)減少，Bak1更多地形成同源二聚體，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)源性凋亡有關(guān)。本研究中空白對(duì)照組與共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率、ALP活性比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在一定程度上說(shuō)明在成骨細(xì)胞中干擾Bak1可以抵消干擾Bcl2的作用，與其在淋巴細(xì)胞[12]中的相關(guān)研究結(jié)果一致。

成骨細(xì)胞的主要功能包括產(chǎn)生膠原纖維和無(wú)定形基質(zhì)形成類骨質(zhì)，分泌骨鈣蛋白、骨黏連蛋白和骨唾液酸蛋白等非膠原蛋白，促進(jìn)骨組織的礦化。成骨細(xì)胞表面存在多種骨吸收刺激因子的受體，能分泌一些細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。BMP4對(duì)于骨骼的發(fā)育和重塑至關(guān)重要[16]。OPN作為成骨細(xì)胞成熟階段的特異性標(biāo)志物之一[16]，在骨改建中維持骨基質(zhì)礦化和骨吸收平衡，介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)間的橋接，可以促進(jìn)骨礦化[17]。Runx2在成骨分化過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用，能夠通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因表達(dá)和成骨細(xì)胞周期，參與成骨細(xì)胞的分化過(guò)程[18]。以上四種蛋白均與成骨細(xì)胞成熟分化及骨形成密切相關(guān)。TNF-α是一種炎性細(xì)胞因子，能直接作用于破骨前體細(xì)胞，并促進(jìn)其分化；還可通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL間接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)骨吸收，對(duì)成骨細(xì)胞功能也有直接影響。本研究結(jié)果顯示，shBcl2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染可降低細(xì)胞BMP4、OPN、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量，提高TNF-α相對(duì)表達(dá)量，shBak1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染則產(chǎn)生相反作用；說(shuō)明沉默Bcl2不僅可促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，還可影響成骨細(xì)胞成熟及分化。本研究中共轉(zhuǎn)染組各成骨相關(guān)蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步說(shuō)明在成骨細(xì)胞中下調(diào)Bak1可以抵消下調(diào)Bcl2的作用，消除下調(diào)Bcl2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)成骨相關(guān)蛋白的影響。

綜上所述，沉默Bcl2基因表達(dá)可抑制MG-63細(xì)胞增殖及成骨能力，沉默Bak1基因則具有相反的作用；Bcl2與Bak1共同參與細(xì)胞凋亡及成骨過(guò)程。本研究為從成骨細(xì)胞凋亡角度干預(yù)骨代謝、防治骨質(zhì)疏松癥提供了新的實(shí)驗(yàn)方法和思路。

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