張君濤，張棟林，吳超超，張超，李思迪，原續(xù)波，尚曼(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津0080；天津中醫(yī)藥大學(xué)；天津大學(xué)；天津醫(yī)科大學(xué))

淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要有效成分，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、抑制破骨細(xì)胞增殖與分化，亦可提高軟骨細(xì)胞代謝活性，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[1,2]。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸可覆蓋和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，改善關(guān)節(jié)攣縮，抑制軟骨表面變性，改善病理性關(guān)節(jié)液分泌，從而發(fā)揮潤滑關(guān)節(jié)的作用[3]。淫羊藿苷和透明質(zhì)酸在骨科治療中均有一定療效，但作用機(jī)理有所差別。理論上二者結(jié)合可更好地發(fā)揮功效。淫羊藿苷和透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備方法一直是臨床相關(guān)的難點及熱點。研究發(fā)現(xiàn)，兔的關(guān)節(jié)軟骨更接近于人的關(guān)節(jié)軟骨，且兔關(guān)節(jié)炎模型中的軟骨退變情況也更接近于人的軟骨退變情況[4]。2017年5～8月，本研究采用化學(xué)合成的方法制備淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物，并觀察其對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損兔軟骨組織的保護(hù)作用。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：6月齡健康新西蘭兔24只，雌雄不限，體質(zhì)量約2.5 kg。藥物：淫羊藿苷(純度≥98%)，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。透明質(zhì)酸(純度98%)，北京索萊寶科技有限公司。透明質(zhì)酸鈉(含1%透明質(zhì)酸)：國藥準(zhǔn)字H10960136，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司。淫羊藿苷含藥血清凍干粉：參照前期研究[5]對成年新西蘭兔灌胃給予淫羊藿苷后獲得含藥血清，低溫?zé)o菌凍干。

1.2 淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備[6～8]

1.2.1 甘氨酸氨基保護(hù) 將2 mmol甘氨酸(Gly)溶解在20 mL NaHCO3溶液中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.68%)，室溫下攪拌1～2 h。將0.45 g二碳酸二叔丁基酯溶解在2 mL二氧六環(huán)中，在冰浴中不斷攪拌的條件下，把二碳酸二叔丁基酯溶液緩慢滴加至Gly溶液中，控制滴速，在10 min內(nèi)滴加完畢，室溫反應(yīng)20 h。用0.01 mol HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)后溶液的pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，將余下固體用二氯甲烷(DCM)溶解，并除去不溶物質(zhì)。將DCM中溶解的反應(yīng)產(chǎn)物滴加至10倍體積的冷乙醚中沉淀，通過抽濾收集固體產(chǎn)物，并采用冷乙醚多次洗滌，最后置于真空干燥箱中干燥，得到叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯。甘氨酸氨基保護(hù)的化學(xué)方程式見圖1。

圖1 甘氨酸氨基保護(hù)的化學(xué)方程式

1.2.2 淫羊藿苷與叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯的脫水縮合反應(yīng) 將淫羊藿苷加入到四氫呋喃(THF)和吡啶的混合溶液中，不斷攪拌至完全溶解，加入一定量叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯，劇烈攪拌1 h；緩慢加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的四氫呋喃溶液，室溫下攪拌反應(yīng)24 h；加入20 mL去離子水，抽濾，洗滌，盡量除去不溶物質(zhì)；通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使溶液濃縮，再將濃縮后的溶液于水中沉淀，將沉淀溶解于THF和吡啶的混合溶液中；加水，冷凍過夜，將不溶物質(zhì)除去，濃縮，加水析出沉淀。如此反復(fù)3次，得到產(chǎn)物。淫羊藿苷與叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯脫水縮合反應(yīng)的化學(xué)方程式見圖2。

圖2 淫羊藿苷與叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯脫水縮合反應(yīng)的化學(xué)方程式

1.2.3 脫除叔丁氧羰基保護(hù) 取1.2.2制備的產(chǎn)物5 g，加入至9 mL三氟乙酸(TFA)和10 mL DCM的混合溶液中，室溫下攪拌1～2 h；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去DCM，所得固體用乙酸乙酯溶解，5%碳酸鈉(NaCO3)洗滌并調(diào)整pH為8～9，除去溶劑，得到第三步反應(yīng)產(chǎn)物氨基淫羊藿苷。脫除叔丁氧羰基保護(hù)的化學(xué)方程式見圖3。

圖3 脫除叔丁氧羰基保護(hù)的化學(xué)方程式

1.2.4 氨基淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的偶聯(lián) 將透明質(zhì)酸加入蒸餾水中，向其中緩慢滴加氨基淫羊藿苷(淫羊藿苷的氨基與透明質(zhì)酸的羧基摩爾比理論上為1∶1～1∶n，本實驗選用1∶10)，并向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，10 mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，10 mg/mL)。將溶液pH調(diào)至4.5，室溫下攪拌反應(yīng)20 min，再將pH調(diào)至5.5，室溫下攪拌24 h。利用柱層析分離得到最終產(chǎn)物，即淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結(jié)合物。氨基淫羊藿苷與透明質(zhì)酸偶聯(lián)的化學(xué)方程式見圖4。

1.3 淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損兔軟骨組織及膠原表達(dá)的影響

1.3.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型制備 參照Charalambous等[9]的方法制備兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，方法如下：將24只健康成年新西蘭兔用速眠新麻醉成功后，仰臥位固定四肢及頭部于專用解剖臺上。右側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，醫(yī)用碘伏常規(guī)消毒，鋪無菌手術(shù)巾。右大腿上段上止血帶，于髕骨旁內(nèi)側(cè)作一縱行切口長約3 cm。依次切開皮膚、皮下組織及筋膜，關(guān)節(jié)囊縱形切開，暴露膝關(guān)節(jié)面，小心避開主要血管、神經(jīng)。將髕骨及股四頭肌腱翻向外側(cè)，清晰顯露股骨髕面。用直徑為3.2 mm的骨科手術(shù)電鉆，于股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨面負(fù)重區(qū)中央處鉆一直徑為4 mm的全層軟骨缺損，深度約3 mm，以缺損區(qū)域滲血為標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)區(qū)域生理鹽水沖洗干凈，0#線全層縫合，無菌敷料包扎。實驗動物麻醉蘇醒后，籠中自由活動。術(shù)前1 h及術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素40 000 U/次，1次/d，以預(yù)防感染。

圖4 氨基淫羊藿苷與透明質(zhì)酸偶聯(lián)的化學(xué)方程式

1.3.2 分組處理 將24只膝關(guān)節(jié)軟骨缺損兔隨機(jī)分為空白對照組、透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組，各6只。模型制備后第3周，空白對照組、透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射0.2 mL生理鹽水、1%透明質(zhì)酸鈉注射液、淫羊藿含藥血清凍干粉(按7 mL血清對應(yīng)的凍干粉量)溶液及淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物(淫羊藿苷含量同淫羊藿苷組)；1次/周，共5周。注射藥物后實驗動物行被動屈伸膝關(guān)節(jié)運(yùn)動，使藥物分布均勻。

1.3.3 相關(guān)指標(biāo)檢測 ①膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)：各組分別于術(shù)后第4、8、12周采用空氣栓塞法各處死2只，切開膝關(guān)節(jié)。將取出的股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)區(qū)域標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈，仔細(xì)觀察其大體形態(tài)，并根據(jù)ICRS評分標(biāo)準(zhǔn)[10]對股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)區(qū)域的色澤、輪廓、完整性以及關(guān)節(jié)內(nèi)有無粘連、增生、腫脹等進(jìn)行評分。ICRS評分包括軟骨表面、軟骨基質(zhì)、細(xì)胞分布、細(xì)胞群發(fā)育能力、軟骨下骨和軟骨礦化各3分，共18分，評分越高表明軟骨缺損修復(fù)越好。②軟骨組織病理學(xué)改變[11]：各組術(shù)后第12周處死并進(jìn)行膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)觀察后，將股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)區(qū)域進(jìn)行固定、脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的軟骨全層切片。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)區(qū)域的結(jié)構(gòu)完整性，細(xì)胞腫脹、增生、變異程度，血管翳生成情況，并進(jìn)行Pineda組織學(xué)半定量評分[12]。Pineda組織學(xué)半定量評分包括缺損填充度4分、骨軟骨連接部重建情況2分、基質(zhì)染色4分、細(xì)胞形態(tài)3分、與宿主周圍細(xì)胞的完整性連接情況2分，共15分，評分越低表明軟骨缺損修復(fù)情況越好。③軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)[13]：取②中制備的軟骨全層切片，行甲苯胺藍(lán)染色，染色后軟骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見紫紅色異染顆粒。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色后采用抗原-抗體特異性反應(yīng)檢測Ⅱ型膠原表達(dá)情況，陽性可見棕褐色顆粒沉著。計算Ⅱ型膠原陽性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 各組膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)比較 術(shù)后第12周，空白對照組膝關(guān)節(jié)軟骨表面的缺損區(qū)外形修復(fù)不完全，表面不平，質(zhì)地較軟，彈性較差，股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨面不完整，可見軟骨下骨暴露。結(jié)合物組膝關(guān)節(jié)軟骨表面缺損區(qū)外形基本完全修復(fù)，關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，呈乳白色，關(guān)節(jié)內(nèi)未見明顯粘連，軟骨退變程度較輕，股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨面恢復(fù)較好。透明質(zhì)酸鈉組和淫羊藿苷組膝關(guān)節(jié)軟骨面修復(fù)接近完整，但關(guān)節(jié)軟骨表面不平，與結(jié)合物組相比恢復(fù)稍差。各組術(shù)后不同時間點膝關(guān)節(jié)ICRS評分比較見表1。

表1 各組術(shù)后不同時間點膝關(guān)節(jié)ICRS評分比較

注：與空白對照組同時間點比較，#P<0.05；與透明質(zhì)酸鈉組同時間點比較，&P<0.05；與淫羊藿苷組同時間點比較，△P<0.05。

2.2 各組軟骨組織病理學(xué)變化比較 術(shù)后第12周，空白對照組股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨損傷處表現(xiàn)為軟骨層廣泛丟失或大量纖維化，被修復(fù)的組織表面不平整，缺損處由纖維肉芽組織填充，周圍組織的細(xì)胞形態(tài)與正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差別較大，軟骨細(xì)胞排列很不規(guī)律，大量細(xì)胞消失，過渡層及輻射層細(xì)胞非常少，細(xì)胞分層不明顯，下潮線消失。結(jié)合物組膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁軟骨缺損處由類軟骨組織修復(fù)，呈修復(fù)狀態(tài)，被修復(fù)區(qū)域表面光滑，裂隙消失，修復(fù)區(qū)域的軟骨細(xì)胞與正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相似，排列比較規(guī)律，結(jié)構(gòu)清晰，下潮線基本恢復(fù)。透明質(zhì)酸鈉組關(guān)節(jié)軟骨缺損處修復(fù)尚未平整，細(xì)胞形態(tài)與正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有區(qū)別，細(xì)胞數(shù)減少，部分有裂隙，排列不規(guī)則，下潮線難以觀察。淫羊藿苷組缺損處細(xì)胞形態(tài)逐漸接近于正常軟骨細(xì)胞，下潮線逐漸恢復(fù)，但修復(fù)情況差于結(jié)合物組?？瞻讓φ战M、透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組HE染色組織學(xué)評分分別為(12.35±2.25)、(6.94±0.83)、(7.29±0.54)、(5.28±0.78)分，透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組HE染色組織學(xué)評分均低于空白對照組，結(jié)合物組HE染色組織學(xué)評分低于透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組(P<0.05或<0.01)。

2.3 各組軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)比較 空白對照組、透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組軟骨組織Ⅱ型膠原陽性表達(dá)率分別為(27.25±2.47)%、(32.63±1.94)%、(34.72±1.58)%、(37.67±1.25)%，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。

3 討論

透明質(zhì)酸是由N-乙酰葡萄糖醛酸反復(fù)交替而形成的一種高分子多糖體生物材料，是關(guān)節(jié)滑液的主要成分，也是軟骨基質(zhì)的成分之一[14]。透明質(zhì)酸在關(guān)節(jié)腔內(nèi)起潤滑作用，可覆蓋和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，改善關(guān)節(jié)攣縮，抑制軟骨表面變性；透明質(zhì)酸進(jìn)入軟骨基質(zhì)后與糖蛋白形成聚合體，能修復(fù)損傷軟骨，改善病理性關(guān)節(jié)液。淫羊藿苷為箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等干燥莖葉提取物，呈淡黃色針狀結(jié)晶粉末，能增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，還具有補(bǔ)腎壯陽、抗衰老等功效[15]。另外淫羊藿苷還具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化、抑制破骨細(xì)胞增殖與分化，提高軟骨細(xì)胞代謝活性，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖等作用。目前臨床中透明質(zhì)酸與淫羊藿苷的適應(yīng)證及給藥方式固定，但其對于骨科相關(guān)疾病只能對癥治療，可短期緩解癥狀，不能逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展。

為提高透明質(zhì)酸和淫羊藿苷對骨科疾病的治療效果，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，本研究突破傳統(tǒng)中藥的給藥方式，提出將二者制備成結(jié)合物。本研究結(jié)果表明，淫羊藿苷與透明質(zhì)酸可以通過化學(xué)偶聯(lián)的方法結(jié)合，該結(jié)合物克服了單一藥物治療的局限性，擴(kuò)大了淫羊藿苷的適用范圍。本研究大體形態(tài)及ICRS評分結(jié)果顯示，淫羊藿苷、透明質(zhì)酸鈉及二者的結(jié)合物均可保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷兔的軟骨組織，以淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物的效果最佳。本研究結(jié)果顯示，空白對照組、透明質(zhì)酸鈉組、淫羊藿苷組、結(jié)合物組軟骨組織Ⅱ型膠原陽性表達(dá)率依次升高，兩組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，表明淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物可促進(jìn)軟骨組織Ⅱ型膠原生成。分析原因，可能是透明質(zhì)酸借助淫羊藿苷對軟骨細(xì)胞的藥理作用，增強(qiáng)其對軟骨表面的覆蓋和保護(hù)作用；淫羊藿苷作用于滑膜細(xì)胞，可促進(jìn)自體高分子透明質(zhì)酸的合成，從而達(dá)到營養(yǎng)軟骨、潤滑關(guān)節(jié)腔、緩解疼痛、改善患者日?；顒蛹瓣P(guān)節(jié)活動范圍等目的。該結(jié)合物作用于軟骨細(xì)胞，可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及黏多糖等活性物質(zhì)的分泌，共同發(fā)揮營養(yǎng)、潤滑、再生、功能重建等作用。

綜上所述，本研究成功制備了淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結(jié)合物，該結(jié)合物可提高膝關(guān)節(jié)軟骨缺損兔軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)并發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結(jié)合物可擴(kuò)大淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的應(yīng)用范圍，突破傳統(tǒng)中藥的給藥方式，使藥物直達(dá)病灶，迅速發(fā)揮作用，達(dá)到靶點治療的效果。目前含中藥成分的關(guān)節(jié)腔注射劑在臨床上尚無報道，淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結(jié)合物的成功制備為關(guān)節(jié)內(nèi)注射用中藥的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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