劉學強，鄭兆廣，王汝上，鐘杰，何桂芳，徐彬(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣州50006；廣州康臣藥業(yè)有限公司腎病藥物研究中心)

人類Thoc1蛋白是酵母轉(zhuǎn)錄蛋白1的一種功能性同源物[1]，能夠結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1的氨基末端結(jié)構(gòu)域。Thoc1可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸，與RNA聚合酶Ⅱ及RNA轉(zhuǎn)錄因子緊密聯(lián)系[2]。癌細胞需要比正常細胞更高的Thoc1水平以維持生理活動[3]，腫瘤組織中Thoc1表達水平也顯著高于正常組織[4]。氯離子通道3(ClC-3)是正常細胞生長和增殖必不可少的，在細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞黏附和細胞運動等方面均發(fā)揮重要作用[5]。ClC-3可調(diào)控細胞周期蛋白表達，其表達水平及在細胞中的分布均呈細胞周期依賴性，但其是否參與細胞轉(zhuǎn)錄過程目前鮮見報道。2017年1～10月，本研究克隆人Thoc1基因并構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體，通過體外轉(zhuǎn)染和免疫熒光技術(shù)觀察Thoc1和ClC-3在人宮頸癌細胞HeLa中的表達及共定位情況，探討ClC-3是否參與了細胞轉(zhuǎn)錄過程。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α、人宮頸癌細胞HeLa和乳腺癌細胞株MCF-7為廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院細胞實驗室保存；pDsRed2-N1載體為Clontech公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 聚合酶均購自NEB(北京)公司；LA Taq酶購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自美國Omega公司；總RNA提取試劑TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美津生物科技有限公司；Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠抗人ClC-3單抗購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰島素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，HeLa細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。兩種細胞均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行以下實驗。

1.3 Thoc1基因克隆 ①Thoc1引物設(shè)計和合成。在GenBank檢索人Thoc1基因核苷酸序列，基因登錄號NM_005131.2，設(shè)計Thoc1引物并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′-GCGCGAGCTCATGTCTCCGACGCCGCCGCT-3′，下游引物：5′-GCGCGGATCCATACTATTTGTCTCATTGTCAT-3′， 上、下游引物分別含SacⅠ和BamHⅠ酶切位點，產(chǎn)物2 092 bp。②Thoc1基因擴增。收集對數(shù)生長期的MCF-7細胞，按TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取細胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用Thoc1引物和LA Taq酶進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系50 μL：模板cDNA 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL， LA Taq(5 U/μL) 0.5 μL，2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mix 8 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，完成30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并鑒定擴增的DNA片段，進行切膠回收。結(jié)果顯示得到的產(chǎn)物只有1條亮帶，位于約2 000 bp的位置，其分子量大小與理論預(yù)期大小2 092 bp相符。見圖1。

注：M為1 kb DNA分子量標準；1為Thoc1基因的PCR產(chǎn)物

圖1Thoc1基因的PCR擴增結(jié)果

1.4 pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pDsRed2-N1，回收Thoc1和pDsRed2-N1線性化載體片段。加入T4 DNA連接酶，于16 ℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，隨機取其中4個克隆進行菌落PCR鑒定。將需經(jīng)PCR鑒定的單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定正確的菌落送華大基因進行測序鑒定，獲得pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體。

1.5 HeLa細胞Thoc1基因表達檢測 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。收集對數(shù)生長期HeLa細胞，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，按1 mL/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板。待細胞融合至70%～80%時，將細胞隨機分為轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及空白對照組，三組分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pThoc1-DsRed2-N1質(zhì)粒、pDsRed2-N1質(zhì)粒及脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達情況并進行拍照。

1.6 HeLa細胞Thoc1和ClC-3共定位觀察 采用免疫熒光技術(shù)。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞，按1.5×104/孔接種于預(yù)先置有圓形蓋玻片的48孔板中，培養(yǎng)24 h。PBS洗掉未貼壁的細胞，免疫染色固定液于室溫固定15 min，封閉液封閉1 h；加入兔抗人ClC-3多克隆抗體，4 ℃反應(yīng)過夜，加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG，室溫避光反應(yīng)1 h；細胞核染色液DAPI室溫避光染色5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，指甲油封固，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。綠色熒光表示ClC-3陽性表達，藍色熒光表示細胞核，紅色熒光表示Thoc1陽性表達。將綠色熒光和紅色熒光進行疊加，如果兩者存在共定位，則紅色和綠色重合在一起，顯示為黃色。

2 結(jié)果

2.1 pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體的鑒定結(jié)果 4個單克隆菌落PCR鑒定結(jié)果均顯示在約2.1 kb處有一亮帶，提示均為陽性克隆菌落(圖2A)。pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體經(jīng)SacⅠ和BamHⅠ雙酶切得到約4.7 kb和2.1 kb的兩個片段(圖2B)，符合預(yù)期大小，證實Thoc1 cDNA成功插入到pDsRed2-N1真核表達載體中?；驕y序結(jié)果顯示，陽性克隆與Genebank中Thoc1基因序列完全一致(圖2C)，證實成功構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體。

2.2 HeLa細胞Thoc1基因表達結(jié)果 空轉(zhuǎn)染組可觀察到較強的紅色熒光，空白對照組沒有觀察到紅色熒光，轉(zhuǎn)染組紅色熒光強度介于空轉(zhuǎn)染組與空白對照組之間；證實HeLa細胞中存在Thoc1表達。

2.3 HeLa細胞Thoc1和ClC-3共定位觀察結(jié)果 ClC-3分布于細胞核和細胞質(zhì)中，主要是細胞核中；Thoc1只分布于細胞核中。兩者疊加后在細胞核呈黃色熒光，證實ClC-3和Thoc1在HeLa細胞核上存在共同定位。

3 討論

Thoc1是轉(zhuǎn)錄輸出復(fù)合物的重要組成部分，在正常組織中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸[2]和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，在胚胎早期發(fā)育過程中扮演重要角色[7]。癌細胞獨特的基因表達需要Thoc1核糖核酸蛋白支持，癌細胞的侵略性表型和不良預(yù)后普遍與Thoc1高表達相關(guān)[8]。因此，Thoc1有可能成為治療癌癥的一個潛在分子靶點。但也有部分肺癌細胞(SPC-A1和NCI-H1975)微量表達Thoc1，這些肺癌細胞經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高Thoc1表達后可誘導(dǎo)細胞周期阻滯和細胞凋亡，從而抑制肺癌細胞生長[9]。因此，Thoc1在正常細胞和癌細胞以及不同組織來源癌細胞中的表達、功能均可能存在明顯差異。

A為單克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。M表示1 kb DNA 分子量標準；1～4表示1～4號單克隆菌落。B為雙酶切鑒定結(jié)果。M表示1 kb DNA 分子量標準；1表示SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定結(jié)果(兩個片段約4.7、2.1 kb)。C為陽性克隆的測序鑒定結(jié)果(因序列過長，此處僅顯示從起始密碼的部分結(jié)果)。

圖2pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體的鑒定結(jié)果

ClC-3是電壓門控氯離子通道的一個亞型，參與多種重要的細胞生理過程，如細胞生長、增殖、分化和遷移[10]，與癌癥病灶的惡化擴大、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。ClC-3在多種腫瘤組織中高表達。Hermoso等[11]發(fā)現(xiàn)，ClC-3在宮頸癌的發(fā)生過程中具有重要作用。ClC-3可增強癌細胞的耐藥性[5]，促進與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞膜皺褶形成，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[12]。因此，ClC-3可能是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)的關(guān)鍵分子之一。ClC-3參與多種細胞生理活動，但其是否參與了細胞轉(zhuǎn)錄目前尚未明確。

pDsRed2-N1載體是以紅色熒光蛋白為報告基因的一種真核表達載體[13]。本課題組將攜帶起始密碼而不帶終止密碼的Thoc1編碼序列克隆到pDsRed2-N1的多克隆位點中，Thoc1 cDNA 序列與 RFP編碼序列形成融合基因，經(jīng)測序證實無讀碼框移位，因此這種N端融合的蛋白可以不改變天然RFP 的熒光性質(zhì)[14]，指示Thoc1蛋白表達和定位[15]。本研究構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體，并通過PCR、SacⅠ和BamHⅠ雙酶切、基因測序鑒定證實。本研究結(jié)果顯示，空轉(zhuǎn)染組可觀察到較強的紅色熒光，空白對照組沒有觀察到紅色熒光，而轉(zhuǎn)染組紅色熒光強度介于空轉(zhuǎn)染組與空白對照組之間；紅色熒光蛋白基因位于Thoc1基因下游，與Thoc1基因共用一個啟動子，因此本研究結(jié)果證實Thoc1在HeLa細胞中有表達。本研究采用免疫熒光技術(shù)觀察到細胞核中存在Thoc1與ClC-3蛋白共定位，提示二者在細胞核中可能存在相互聯(lián)系。ClC-3是與Thoc1直接結(jié)合還是通過其他蛋白分子進行間接連接，仍需要進一步研究。由于Thoc1在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用，提示ClC-3也有可能參與了細胞核中的轉(zhuǎn)錄過程，或具備參與細胞轉(zhuǎn)錄、RNA加工的功能。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pThoc1-DsRed2-N1真核表達載體；Thoc1與ClC-3共定位于HeLa細胞核，提示ClC-3可能參與細胞轉(zhuǎn)錄過程。

參考文獻：

[1] Chinnam M, Wang X, Zhang X, et al. Evaluating effects of hypomorphic Thoc1 alleles on embryonic development in Rb1 null mice[J]. Mol Cell Biol, 2016,36(11):1621-1627.

[2] Li Y, Wang X, Zhang XD. Human hHpr1/p84/Thoc1 regulates transcriptional elongation and physically links RNA polymerase Ⅱ and RNA processing factors[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(10):4023-4033.

[3] Li Y, Lin AW, Zhang X, et al. Cancer cells and normal cells differ in their requirements for Thoc1[J]. Cancer Res, 2007,67(14):6657-6664.

[4] Yang J, Li Y, Khoury T, et al. Relationships of hHpr1/p84/Thoc1 expression to clinicopathologic characteristics and prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Ann Clin Lab Sci, 2008,38(2):105-112.

[5] Hong S, Bi M, Wang L, et al. ClC-3 channels in cancer[J]. Oncol Report, 2015,33(2):507-514.

[6] 秦建民.信號調(diào)節(jié)蛋白在生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及意義[J].醫(yī)學分子生物學雜志, 2002,24(1):41-44.

[7] Wang X, Chang Y, Li Y, et al. Thoc1/Hpr1/p84 is essential for early embryonic development in the mouse[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(11):4362-4367.

[8] Liu C, Yue B, Yuan C, et al. Elevated expression of Thoc1 is associated with aggressive phenotype and poor prognosis in colorectal cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,468(1-2):53-58.

[9] Wan J, Zou S, Hu M, et al. Thoc1 inhibits cell growth via induction of cell cycle arrest and apoptosis in lung cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2014,9(6):2321-2327.

[10] Guo R, Pan F, Tian Y, et al. Down-Regulation of ClC-3 expression reduces epidermal stem cell migration by inhibiting volume-activated chloride currents[J]. J Membr Biol, 2016,249(3):281-292.

[11] Hermoso M, Satterwhite CM, Andrade YN, et al. ClC-3 is a fundamental molecular component of volume-sensitive outwardly rectifying Cl- channels and volume regulation in HeLa cells and Xenopus laevis oocytes[J]. J Biol Chem, 2002,277(42):40066-40074.

[12] Xu B, Jin X, Min L, et al. Chloride channel-3 promotes tumor metastasis by regulating membrane ruffling and is associated with poor survival[J]. Oncotarget, 2015,6(4):2434-2450.

[13] 邢萬金,趙宇航,任仕超,等.紅色熒光蛋白DsRed2基因在大腸桿菌中的表達和觀察及其在本科實驗教學中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古大學學報(自然版),2008,39(5):548-551.

[14] 馬騫,甄誠,滿江紅,等.GGT1基因的真核表達載體構(gòu)建及其表達定位[J].科學技術(shù)與工程,2010,10(22):5490-5492.

[15] Baird GS, Zacharias DA, Tsiein RY. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(22):11984-11989.