王健波，彭吾訓(xùn)，張健，張飛，張槐，趙胤，李青，鄧進(jìn)(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550000)

股骨頭缺血壞死是以股骨頭嚴(yán)重缺少血液供應(yīng)和骨內(nèi)壓明顯升高為病理特征的髖關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素較多[1,2]。目前治療股骨頭缺血壞死的方法有很多，如髓芯減壓、骨移植、關(guān)節(jié)成形及關(guān)節(jié)置換等[3]，但每一種方法均有不足。目前，以基因轉(zhuǎn)染技術(shù)改造或加強(qiáng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為種子細(xì)胞的組織工程骨已逐漸用于股骨頭缺血壞死的治療，但移植后MSCs凋亡的機(jī)制尚未完全明確[4]。TNF-α在 MSCs的凋亡過(guò)程中發(fā)揮不可忽視的作用。2016年10月～2017年8月，本研究以異種脫抗原松質(zhì)骨(XACB)作為構(gòu)建組織工程骨的支架材料，利用慢病毒為載體介導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)基因轉(zhuǎn)染兔MSCs，并與XACB復(fù)合培養(yǎng)，制備了組織工程骨XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2；現(xiàn)分析其對(duì)兔激素性股骨頭缺血壞死的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：6周齡新西蘭大白兔5只，雌雄不限，體質(zhì)量1.0～1.5 kg；3月齡新西蘭大白兔80只，雌雄不限，體質(zhì)量3.5～4.0 kg；均購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；Percoll分離液(美國(guó)Sigma公司)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)科技有限公司)。主要儀器：CO2孵箱(Thermo forma 31I，美國(guó))，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，NDl000型核酸蛋白測(cè)量?jī)x(美國(guó)Nanodrop公司)，C1000型PCR擴(kuò)增儀、iCycler iQ熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 組織工程骨XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2的制備

1.2.1 兔MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 選擇6周齡新西蘭大白兔5只，靜脈麻醉后于股骨及脛骨處用骨髓穿刺針抽取骨髓，采用密度梯度離心法和貼壁法行細(xì)胞分離培養(yǎng)。選取第3代MSCs，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、外形均一、排列整齊呈魚(yú)群狀。使用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型分子CD44表達(dá)，結(jié)果顯示CD44陽(yáng)性率>99%。采用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs，并行茜素紅染色及ALP染色。結(jié)果均呈陽(yáng)性，茜素紅染色可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)被染成橘紅色，ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒染色呈黑色。證實(shí)分離出的細(xì)胞是MSCs。

1.2.2 兔MSCs轉(zhuǎn)染 ①慢病毒介導(dǎo)FGF-2基因轉(zhuǎn)染MSCs：取生長(zhǎng)狀況良好的第3代兔MSCs隨機(jī)分為病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，依據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)確定的MOI值(50)，病毒轉(zhuǎn)染組加入載有FGF-2基因的慢病毒液，空病毒轉(zhuǎn)染組加入未載有FGF-2基因的慢病毒液，空白對(duì)照組加慢病毒稀釋液，使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡下可見(jiàn)大量的GFP，空白對(duì)照組未見(jiàn)GFP。②穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選：根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。采用Western blottting法檢測(cè)各組FGF-2蛋白相對(duì)表達(dá)量(條帶灰度值)，結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組FGF-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.757±0.034、0.457±0.015、0.428±0.012，病毒轉(zhuǎn)染組明顯高于空病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組(P均<0.05)。采用qRT-PCR法檢測(cè)各組FGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(采用2-ΔΔCt法計(jì)算)，結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組FGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為32.016±3.902、3.531±0.638、1.023±0.007 ，病毒轉(zhuǎn)染組明顯高于空病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組(P均<0.05)。證實(shí)嘌呤霉素篩選得到的病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株可穩(wěn)定表達(dá)FGF-2，病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組分別獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞MSCs/Lv-GFP-FGF-2、MSCs/Lv-GFP。③細(xì)胞株與XACB復(fù)合培養(yǎng)：分別調(diào)整病毒轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組的細(xì)胞密度為5×106/mL，將預(yù)處理的XACB置入6孔板中。分別加入各組細(xì)胞懸液約100 μL/孔，與完全培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，分別獲得組織工程骨XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2、XACB/MSCs/Lv-GFP、XACB/MSCs。培養(yǎng)第6天，電鏡下觀察細(xì)胞株附著、分布、生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染組XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2細(xì)胞株伸出偽足，向周?chē)煺梗接赬ACB并且生長(zhǎng)良好。

1.3 XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2對(duì)兔股骨頭缺血壞死的治療作用及其對(duì)股骨頭組織TNF-α表達(dá)的影響

1.3.1 模型制備及分組處理 選擇3月齡新西蘭大白兔80只，參照Wu等[5]的方法，采用內(nèi)毒素與甲基強(qiáng)的松龍制備兔激素性股骨頭缺血壞死模型。建模后8周行MRI檢查，T1像示股骨頭關(guān)節(jié)軟骨下呈點(diǎn)狀、片狀低信號(hào)，T2像示股骨頭關(guān)節(jié)軟骨下呈點(diǎn)狀、片狀高信號(hào)，判定激素性股骨頭缺血壞死模型建立成功[6]。選擇建模成功的激素性股骨頭缺血壞死兔60只隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，各12只。各組均靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，無(wú)菌操作下髖關(guān)節(jié)外側(cè)切口，顯露股骨頭，于股骨頭頸交界處開(kāi)口行髓芯減壓，A組不植骨、B組植入自體松質(zhì)骨、C組植入XACB/MSCs、D組植入XACB/MSCs/Lv-GFP、E組植入XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2。植入后縫合傷口，術(shù)后使用抗生素預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如有死亡動(dòng)物則立刻補(bǔ)齊，保證每組可利用樣本均為12只。

1.3.2 股骨頭大體形態(tài)觀察 術(shù)后3、6、12周，各組分別隨機(jī)選擇4只兔處死，于無(wú)菌條件下取出股骨頭，先觀察股骨頭表面情況，再沿股骨頭冠狀面剖開(kāi)，觀察股骨頭缺血壞死區(qū)修復(fù)情況。

1.3.3 股骨頭組織TNF-α表達(dá)檢測(cè) ①免疫組化法：將各組不同時(shí)期的股骨頭組織分為兩部分，一部分保存于液氮中；另一部分標(biāo)本用EDTA脫鈣液脫鈣后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成5 μm厚度的切片，常規(guī)行免疫組織化學(xué)染色。TNF-α抗原表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞被染成棕黃色，細(xì)胞排列不整、形態(tài)紊亂。采用Image-Pro Plus圖像計(jì)數(shù)軟件隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率，取平均值。②Real-time PCR法：取各組不同時(shí)期保存于液氮中的股骨頭組織，液氮中研磨呈粉狀后，采用TRIzol法提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。TNF-α及內(nèi)參基因β-actin引物均采用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)合成。TNF-α上游引物：5′-TAGTAGCAAACCCGCAAG-3′，下游引物：5′-AAGAGAACCTGGGAGTAGATG-3′；β-actin上游引物：5′-ATCAGCAAGCAGGAGTAT-3′，下游引物：5′-CAATCTCGTCTCGTTTCTG-3′。PCR反應(yīng)總體系20 μL： 2×qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水6.4 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組股骨頭大體形態(tài)比較 所有股骨頭無(wú)脫位、塌陷及骨折。術(shù)后3周，A組缺損區(qū)與周?chē)墙M織界限清晰，由肉芽組織填充；B、C、D組缺損區(qū)移植骨吸收不完全，缺損區(qū)界限清晰，由肉芽組織填充，周?chē)?jiàn)少量新骨形成；E組移植骨未完全吸收，缺損區(qū)界限清晰，周?chē)?jiàn)新骨形成。術(shù)后6周，A組缺損區(qū)由肉芽組織填充，仍無(wú)明顯新骨形成；B組移植骨吸收不全，缺損區(qū)界限清晰，由肉芽組織填充，周?chē)行鹿切纬?；C、D組缺損區(qū)仍清晰可見(jiàn)，邊緣可見(jiàn)明顯新骨形成，中央由肉芽組織填充；E組大部分缺損區(qū)已被新骨填充，界限模糊，移植骨已基本被吸收。術(shù)后12周，A組缺損區(qū)幾乎由結(jié)締組織填充，周?chē)?jiàn)少許新骨形成；B組缺損區(qū)移植骨與周?chē)９墙缦掭^清晰，可見(jiàn)新骨形成；C、D組缺損區(qū)移植骨完全被吸收，周?chē)罅啃鹿切纬桑醒肟梢?jiàn)少量結(jié)締組織填充；E組移植骨與周?chē)９墙M織界限不清，骨修復(fù)程度接近正常松質(zhì)骨。

2.2 各組股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率比較 術(shù)后3、6、12周，B、C、D、E組股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率均逐漸降低(P均<0.05)。術(shù)后3周，E組股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率低于A、B、C、D組(P均<0.05)；術(shù)后6、12周相同時(shí)間點(diǎn)，股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率A組>B組>C、D組>E組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：與同組術(shù)后3周比較，aP<0.05；與同組術(shù)后6周比較，bP<0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；與B組同時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.05；與C組同時(shí)間點(diǎn)比較，eP<0.05；與D組同時(shí)間點(diǎn)比較，fP<0.05。

2.3 各組股骨頭組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 術(shù)后3、6、12周，B、C、D、E組股骨頭組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均逐漸降低(P均<0.05)。術(shù)后3周，E組股骨頭組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于A、B、C、D組(P均<0.05)；術(shù)后6、12周相同時(shí)間點(diǎn)，股骨頭組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量A組>B組>C、D組>E組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組股骨頭組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與同組術(shù)后3周比較，aP<0.05；與同組術(shù)后6周比較，bP<0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；與B組同時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.05；與C組同時(shí)間點(diǎn)比較，eP<0.05；與D組同時(shí)間點(diǎn)比較，fP<0.05。

3 討論

股骨頭缺血壞死的發(fā)病機(jī)制包括多種理論體系，如血管內(nèi)凝血及骨壞死學(xué)說(shuō)、脂肪栓塞學(xué)說(shuō)、骨質(zhì)疏松與顯微骨折學(xué)說(shuō)及骨內(nèi)壓增高理論等[7,8]，其病理變化為骨細(xì)胞壞死。以MSCs 為種子細(xì)胞，結(jié)合基因轉(zhuǎn)染技術(shù)與組織工程技術(shù)是目前治療股骨頭缺血壞死的研究熱點(diǎn)[9]。MSCs是骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一類(lèi)多能干細(xì)胞，免疫原性弱，可誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、神經(jīng)、肌肉等組織，是細(xì)胞工程和基因工程的理想載體細(xì)胞。MSCs不僅可以攜帶目的基因，還可發(fā)揮細(xì)胞替代和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特殊作用[10～12]。bFGF 不僅具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞分化增殖，協(xié)同其他骨生長(zhǎng)因子成骨；還能促進(jìn)毛細(xì)血管生長(zhǎng)，有利于新骨形成和替代[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的MSCs在形態(tài)上與轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯差別，并可成功表達(dá)bFGF[15,16]。本研究利用慢病毒為載體介導(dǎo)FGF-2基因轉(zhuǎn)染兔MSCs，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的MSCs可大量表達(dá)GFP，F(xiàn)GF-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，證實(shí)嘌呤霉素篩選得到的病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株可穩(wěn)定表達(dá)FGF-2。自體骨移植在修復(fù)過(guò)程中主要為軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨提供結(jié)構(gòu)性支撐，以防止塌陷[17]。XACB具備良好的生物相容性及合適的力學(xué)強(qiáng)度，具有天然的多孔結(jié)構(gòu)和合適的孔隙率，利于復(fù)合種子細(xì)胞及骨誘導(dǎo)因子，便于血管組織的長(zhǎng)入和軟骨分化形成[18]。本研究將病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株與XACB進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，得到XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2，電鏡結(jié)果顯示其細(xì)胞株伸出偽足，向周?chē)煺梗接赬ACB并且生長(zhǎng)良好；證實(shí)成功獲得組織工程骨XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2。

本研究激素性股骨頭缺血壞死模型股骨頭組織病理學(xué)以骨髓細(xì)胞壞死、骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞增多為主要表現(xiàn)，符合股骨頭缺血壞死病理變化，適合用于股骨頭缺血壞死治療的相關(guān)研究。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后3周，E組可見(jiàn)少量新骨形成，其余各組均未見(jiàn)新骨形成。術(shù)后6周，A組缺損區(qū)由肉芽組織填充，仍無(wú)明顯新骨形成；B、C、D組缺損區(qū)仍清晰可見(jiàn)，邊緣可見(jiàn)新骨形成；E組大部分缺損區(qū)已被新骨填充，移植骨已基本吸收。術(shù)后12周，A組僅有少量新骨形成，B、C、D組均未完全修復(fù)，E組缺損區(qū)修復(fù)接近正常松質(zhì)骨。說(shuō)明XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2移植治療兔激素性股骨頭缺血壞死的效果較好。Samara等[19]研究顯示，大量炎癥因子參與股骨頭缺血壞死的發(fā)展過(guò)程，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α。TNF-α是參與骨重建的促炎因子之一[20]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后3周，E組股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于A、B、C、D組；術(shù)后6、12周相同時(shí)間點(diǎn)，股骨頭組織TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA相對(duì)表達(dá)量A組>B組>C、D組>E組。說(shuō)明XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2治療兔激素性股骨頭缺血壞死的機(jī)制可能與其降低股骨頭組織TNF-α表達(dá)有關(guān)。分析原因，轉(zhuǎn)染FGF-2基因的MSCs在股骨頭缺血壞死早期即可促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和毛細(xì)血管生長(zhǎng)，并下調(diào)TNF-α表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究成功制備了組織工程骨XACB/MSCs/Lv-GFP-FGF-2；其治療兔激素性股骨頭缺血壞死的效果較好，作用機(jī)制可能為抑制股骨頭組織TNF-α表達(dá)。

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