王建茹，張育敏，韓波(山西醫(yī)科大學(xué)，太原030006；山西中醫(yī)藥大學(xué))

腫瘤、先天畸形、創(chuàng)傷等各種原因均可造成骨缺損，理想的骨修復(fù)材料應(yīng)具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)能力[1,2]。但是目前臨床應(yīng)用的羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣僅具備骨傳導(dǎo)性，植入后易出現(xiàn)骨不連和延遲愈合。研究發(fā)現(xiàn)，骨修復(fù)材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等生長(zhǎng)因子復(fù)合后具有骨誘導(dǎo)性能，但BMP等生長(zhǎng)因子制備工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴，且活性不穩(wěn)定，具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)[3,4]。淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨等功效，常用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征等疾病[5,6]。淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，淫羊藿能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，并提高DNA形成和骨組織蛋白質(zhì)合成[8,9]。2016年7月～2017年7月，本研究觀察了淫羊藿苷對(duì)MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)作用，并確定其最佳作用濃度，旨在為其用于骨組織再生提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。主要試劑：淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胰酶(Sigma，美國(guó))，堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鈣測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司)，死/活細(xì)胞熒光染色試劑盒(天津衛(wèi)凱生物工程有限公司)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2，北京百靈克公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器：SterilGARDⅢ超凈工作臺(tái)(Baker，美國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus，美國(guó)), 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))，高壓滅菌器(Hirayama，德國(guó))，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，Nikon Eclipse TE2000-U熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 淫羊藿苷溶液配制 將67.67 mg淫羊藿苷加入10 mL二甲基亞砜(DMSO)，配制成10 mmol/L的儲(chǔ)存液。儲(chǔ)存液中加入不同體積的培養(yǎng)液配制成終濃度分別為1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L的工作液。

1.3 細(xì)胞分組處理 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中采用10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基復(fù)蘇MC3T3-E1細(xì)胞，適當(dāng)傳代后，制備細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL。將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組、陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。觀察組分別加入終濃度為1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷溶液100 μL，陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組分別加入等體積含DMSO的培養(yǎng)基及rhBMP-2。

1.4 淫羊藿苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的毒性觀察

1.4.1 細(xì)胞增殖能力 采用MTT法。取100 μL MC3T3-E1細(xì)胞懸液接種到96孔板，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基。參照1.3的方法進(jìn)行分組處理，每2天更換2/3培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)第3、7天每孔加入50 mg/mL的MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸出孔中培養(yǎng)液，每孔再加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。以加入正常培養(yǎng)基的細(xì)胞作為正常對(duì)照孔，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=OD實(shí)驗(yàn)孔/OD正常對(duì)照孔×100%。

1.4.2 細(xì)胞活力 采用死/活細(xì)胞熒光染色法。取500 μL MC3T3-E1細(xì)胞懸液接種到24孔板，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基。參照1.3的方法進(jìn)行分組處理，加入藥物體積均為500 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。去除培養(yǎng)基，參照死/活細(xì)胞熒光染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，Calcein-AM可將活細(xì)胞染成綠色，EthD-1可將死亡細(xì)胞染成紅色。5 min后熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞與死細(xì)胞情況，采用Image pro plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)死細(xì)胞與活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 淫羊藿苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化影響的觀察

1.5.1 細(xì)胞鈣化情況 采用茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色。取100 μL MC3T3-E1細(xì)胞懸液接種到24孔培養(yǎng)板，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，參照1.3的方法進(jìn)行分組處理。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每3天換液1次，每次換液量為培養(yǎng)液的2/3，培養(yǎng)2周。采用茜素紅S染色法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞是否形成鈣化結(jié)節(jié)，方法如下：將1 g茜素紅溶于100 mL蒸餾水中，用氨水將pH值調(diào)整為6.36～6.40。無(wú)鈣、鎂PBS沖洗3遍，收集細(xì)胞，10%甲醛溶液(用PBS溶解)固定1 h，蒸餾水沖洗5遍，茜素紅溶液染色5 min。倒置相差顯微鏡下觀察染色鈣化結(jié)節(jié)形成情況。

1.5.2 ALP活性、鈣含量及骨鈣素表達(dá) 采用細(xì)胞超聲裂解法。參照1.5.1的方法分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)2周后，用無(wú)鈣、鎂Hanks液清洗貼壁細(xì)胞2遍，胰酶消化收集細(xì)胞。用無(wú)鈣、鎂Hanks液清洗細(xì)胞2遍(1 000 r/min離心2 min)，加入0.2%Nonidet P-40 (NP-40)1 mL重新懸浮細(xì)胞，在冰浴中超聲裂解2 min，將細(xì)胞裂解液凍存于-20 ℃待用。ALP活性、鈣含量及骨鈣素檢測(cè)均嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力比較 培養(yǎng)第3天，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。培養(yǎng)第7天，加入1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。加入1×10-3mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞存活率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞存活率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率及細(xì)胞存活率比較

注：與同組第3天比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞鈣化情況比較 陰性對(duì)照組未見(jiàn)明顯紅染鈣化結(jié)節(jié)，陽(yáng)性對(duì)照組有明顯的鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞呈聚集樣生長(zhǎng)，在匯集的中央首先出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。觀察組隨著加入淫羊藿苷濃度的升高，紅染鈣化結(jié)節(jié)面積逐漸增大，其中加入1×10-6、1×10-5mmol/L淫羊藿苷的觀察組僅見(jiàn)散在鈣化結(jié)節(jié)；當(dāng)淫羊藿苷濃度≥1×10-4mmol/L時(shí)，鈣化紅染區(qū)域逐漸連接成片。

2.3 各組ALP活性、鈣含量及骨鈣素表達(dá)比較 隨著加入淫羊藿苷溶液濃度的升高，觀察組ALP活性、鈣含量及骨鈣素表達(dá)均逐漸升高。加入不同濃度淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞ALP活性均高于陰性對(duì)照組、低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。加入1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞鈣含量均高于陰性對(duì)照組，加入1×10-6、1×10-5、1×10-4mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞鈣含量均低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。加入不同濃度淫羊藿苷溶液的觀察組細(xì)胞骨鈣素表達(dá)均高于陰性對(duì)照組，加入1×10-6、1×10-5mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞骨鈣素表達(dá)均低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組ALP活性、鈣含量及骨鈣素表達(dá)比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討論

淫羊藿苷作為傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，常被用于治療骨骼疾病?？祵W(xué)等[10]采用含淫羊藿的骨松寶膠囊治療40例骨質(zhì)疏松患者，結(jié)果顯示患者治療后骨密度升高。朱貴忱等[11]將80例骨質(zhì)疏松患者隨機(jī)分為鈣爾奇D組和鈣爾奇D聯(lián)合淫羊藿顆粒組，治療6個(gè)月顯示，鈣爾奇D聯(lián)合淫羊藿顆粒組臨床有效率、腰背痛緩解時(shí)間、血清骨鈣素水平及骨密度均明顯優(yōu)于鈣爾奇D組，并認(rèn)為淫羊藿能促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨作用。既往大量研究證實(shí)，淫羊藿中的淫羊藿苷成分可能在促進(jìn)成骨方面發(fā)揮主要作用[12,13]。

細(xì)胞毒性和成骨誘導(dǎo)活性是評(píng)價(jià)骨誘導(dǎo)材料安全性和有效性的重要指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)第3天加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組；培養(yǎng)第7天，加入1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組；加入1×10-3mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞存活率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞存活率明顯低于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。證實(shí)1×10-6～1×10-4mmol/L的淫羊藿苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞毒性較小，安全性較高。細(xì)胞在體外向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化時(shí)，主要經(jīng)歷細(xì)胞增殖期和細(xì)胞分化期。細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)條件后大量增殖，進(jìn)入生長(zhǎng)增殖期，隨即細(xì)胞數(shù)量增多，開(kāi)始呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞界限變模糊；在誘導(dǎo)環(huán)境下，細(xì)胞進(jìn)入分化期，開(kāi)始分泌膠原蛋白、ALP等，促使鈣在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)沉積，形成鈣化結(jié)節(jié)。增殖和分化是細(xì)胞生命活動(dòng)的兩個(gè)方面，增殖中的細(xì)胞其分化功能受到抑制，而分化中的細(xì)胞其增殖能力降低。當(dāng)細(xì)胞分化后，就失去增殖的潛能[15]。本研究加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷溶液的觀察組培養(yǎng)第7天細(xì)胞增殖率明顯低于培養(yǎng)第3天，也間接證實(shí)了在細(xì)胞增殖過(guò)程中存在部分細(xì)胞的分化，而細(xì)胞分化又進(jìn)一步降低了細(xì)胞增殖率。

ALP 是一種鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分布于細(xì)胞膜，具有促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化的功能，為成骨分化的早期標(biāo)志物，其出現(xiàn)于基質(zhì)合成期，于鈣化期達(dá)到高峰[16]。ALP 活性越高代表成骨前體細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞的分化越明顯，因此ALP 活性常作為一個(gè)重要指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞的分化程度。Ca含量是成骨細(xì)胞分化的另一重要指標(biāo)。骨鈣素是由非增殖期成骨細(xì)胞合成和分泌的一種特異性非膠原骨基質(zhì)蛋白，能保持骨的礦化速度，是成骨細(xì)胞成骨功能的敏感標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，加入不同濃度淫羊藿苷的觀察組ALP活性均高于陰性對(duì)照組、低于陽(yáng)性對(duì)照組；加入1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞鈣含量均高于陰性對(duì)照組，加入1×10-6、1×10-5、1×10-4mmol/L淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞鈣含量均低于陽(yáng)性對(duì)照組，加入不同濃度淫羊藿苷的觀察組細(xì)胞骨鈣素表達(dá)均高于陰性對(duì)照組。說(shuō)明1×10-4mmol/L淫羊藿苷具有升高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞鈣含量和骨鈣素表達(dá)的作用，且對(duì)細(xì)胞的毒性作用較小，是淫羊藿苷用于修復(fù)骨缺損的一個(gè)安全、有效劑量。

綜上所述，1×10-4mmol/L淫羊藿苷溶液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，其成骨誘導(dǎo)作用與rhBMP-2接近，可作為一種骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子替代劑聯(lián)合骨修復(fù)材料用于促進(jìn)骨組織再生。關(guān)于淫羊藿苷與臨床常用的骨修復(fù)材料復(fù)合用于促進(jìn)骨再生的效果仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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