唐麗　夏瑞　李弦

【摘要】 目的：探索肺血管內(nèi)皮細胞糖萼在肺損傷中的作用。方法：采用盲腸結扎穿孔法構建大鼠膿毒癥急性肺損傷模型。將30只大鼠隨機分為3組，A組為空白對照組，B組為膿毒癥組，C組為肝素鈉預處理膿毒癥組。24 h后觀察大鼠肺組織病理切片、動脈血氧分壓和細胞凋亡指數(shù)，ELISA法檢測血清中硫酸乙酰肝素酶（HPA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、硫酸乙酰肝素（HS）和多配體聚糖（Syndecan-1）的含量。結果：與A組比較，B組和C組病理切片均有明顯肺損傷表現(xiàn)，動脈血氧分壓中氧分壓降低，二氧化碳分壓升高，細胞凋亡指數(shù)較高；與B組比較，C組動脈血氧分壓中氧氣分壓增高，二氧化碳分壓降低，細胞凋亡指數(shù)較低；ELISA法結果表明，與A組比較，B組和C組HPA、MMP-9含量較少，HS和Syndecan-1含量顯著較高；與B組比較，C組HPA、MMP-9較高，HS和Syndecan-1較低，差異均有統(tǒng)計學意義。結論：肺血管內(nèi)皮細胞糖萼在急性肺損傷進程中起到保護作用。

【關鍵詞】 肺血管內(nèi)皮細胞糖萼； 急性肺損傷； 保護作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.3.087 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）03-0162-02

急性肺損傷（acute lung injure，ALI）是臨床上常見的肺部損傷，是呼吸系統(tǒng)最嚴重的疾病之一，嚴重時可以導致患者死亡。血管內(nèi)皮細胞糖萼（endothelial glycocalyx layer，EGL）是一種網(wǎng)狀的絨毛結構，覆蓋在血管內(nèi)皮的腔面，主要由氨基葡聚糖（glycosaminoglycan，GAG），蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）和膜糖蛋白（glycoproteins）組成。正硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）是內(nèi)皮細胞糖萼分布最多的糖胺聚糖。脫氧膽酸鈉（SDC）是PGs的核心蛋白之一。血管內(nèi)皮細胞糖萼是血管屏障的重要組成部分，通過改變血管內(nèi)皮細胞通透性，阻隔中性粒細胞外滲和黏附，提供對血管的保護作用。HPA和MMP-9是糖萼的破壞因素，而硫酸乙酰肝素（HS）和多配體聚糖（Syndecan-1）是糖萼脫落的標志物。HPA是分解HS的酶，MMP-9可以降解Syndecan-1蛋白[1-2]。本研究建立大鼠肺損傷模型，利用肝素鈉作為肺內(nèi)皮細胞糖萼的保護性因素，通過檢測肺組織內(nèi)細胞凋亡數(shù)、肺血氧分壓狀況、血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量及觀察鏡下肺組織的病理改變情況，對EGL在急性肺損傷中的作用進行探索性的研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

30只雄性健康SD大鼠（湖北省疾病控制中心提供），體重210～260 g，將大鼠隨機分為3組：常規(guī)對照組（A組，10只）、常規(guī)肺損傷建模組（B組，10只）、肝素預處理肺損傷建模組（C組，10只）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與藥品 血氣分析儀（ABBOTT i-STAT），實驗中所用試劑購自武漢谷歌生物科技有限公司，細胞凋亡測試盒購自武漢博士德生物工程有限公司，ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.2 急性肺損傷大鼠模型 大鼠麻醉用藥為3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），將所有大鼠注射麻醉后，對C組大鼠經(jīng)尾靜脈注射肝素（2 mg/ml）3 ml/kg進行預處理，對照組注入等量生理鹽水，而后按照文獻[3]介紹的盲腸結扎穿孔法建造膿毒癥肺損傷模型。常規(guī)消毒鋪巾，沿腹正中切口切開，切口長2～3 cm，打開腹腔，游離腸系膜和盲腸，環(huán)形結扎盲腸1/2處，用50 ml注射器9號針頭穿孔于盲腸和尾端中點，擠出少許內(nèi)容物，還納腸管，保證腸道通暢，對傷口進行逐層縫合。傷口消毒后以5 ml/100 mg生理鹽水腹腔注射補液。

1.3 觀察指標

（1）24 h后取大鼠股動脈血0.5 ml血氣分析，而后處死大鼠，取右肺上葉1 cm3，4%多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋、HE染色，在顯微鏡下對肺組織進行觀察。記錄視野內(nèi)肺內(nèi)皮、肺上皮陽性染色細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)（AI）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。（2）血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量檢測。處死大鼠前，取大鼠血1 ml，4000 r/min離心15 min，取血清置于-80 ℃冰箱備用。HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1檢測方法參照大鼠HPA、MMP-9、HS、Syndecan-l（sCD138） ELISA試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理改變

A組為空白對照組，大鼠肺泡組織、肺間質(zhì)均較完整，無病理改變；B組肺泡及肺間質(zhì)可見炎性細胞浸潤及出血，結構發(fā)生嚴重破壞，肺毛細血管擴張，肺泡壁明顯增厚。C組病理情況總體處于A組與C組之間，肺泡和肺間質(zhì)有病理改變，但相較于B組程度較輕。

2.2 細胞凋亡情況

A組AI值最低，分布較分散，著色最淺。B組AI值最高，與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），C組AI值低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 動脈血氣分析

動脈血氣分析結果表明，A組PaO2和PaCO2基本處于正常值，B組PaO2降低，PaCO2升高，C組相比于A組PaO2降低和PaCO2升高，但降低值和增高值不及B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.4 血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量

ELISA法結果表明，與A組相比，B組和C組HPA、MMP-9含量較低，HS和Syndecan-1含量顯著較高；但C組HPA、MMP-9減少量、HS和Syndecan-1增高量不及B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

盲腸結扎穿孔是多種病原微生物感染引發(fā)的膿毒癥模型，能夠很好地模擬臨床上人類膿毒癥的急性肺損傷[3-4]。本研究中，造模后大鼠出現(xiàn)發(fā)熱，呼吸頻率加快，心率加快、口鼻腔分泌物增多、腹瀉、精神萎靡、豎毛、少動、血氣分析顯示模型組大鼠PaO2下降和PaCO2升高，都證明急性肺損傷模型構建成功。

急性肺損傷的主要病理變化為炎性因子刺激導致的細胞通透性增加，EGL的主要生理作用是在血管內(nèi)皮形成分子層，能夠具有炎性屏障和機械傳導的功能，因此EGL對于減緩炎性損傷進程有重要作用[5-6]。肝素對EGL有保護功能，文獻[7-8]研究表明，在大鼠膿毒癥急性腎損傷模型中，給予靜脈注射肝素，腎間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腎小球內(nèi)皮細胞的乙酰肝素酶活化減少，內(nèi)皮細胞糖萼破壞減少，從而分別導致腎間質(zhì)白細胞浸潤和腎小球濾過屏障破壞，引發(fā)炎癥和蛋白尿情況明顯降低。這證實了EGL在急性肺損傷中對肺組織的保護作用[9-10]。

本研究結果中，與A組相比，B組和C組HPA、MMP-9含量較少，HS和Syndecan-1含量顯著較高；但與B組比較，C組HPA、MMP-9較高，HS和Syndecan-1較少，這表明在急性肺損傷的發(fā)生過程中，糖萼確實發(fā)生結構的破壞。而C組大鼠的急性肺損傷程度明顯較低，說明血管內(nèi)皮細胞糖萼的損傷情況與肺損傷程度呈相關性，糖萼破壞程度越高，肺損傷的程度越重。膿毒癥時，損傷肺組織內(nèi)大量細胞發(fā)生凋亡，調(diào)控細胞凋亡可能保護肺組織，但EGL破壞是否與細胞凋亡有關尚需研究證實[11-12]。

本研究初步證實了EGL在肺損傷發(fā)生時對血管內(nèi)皮的保護作用，但預處理是在肺損傷發(fā)生前進行，而肺損傷是急進過程，相關物質(zhì)是否能及時起效及起效時間尚未可知，需要進一步的研究后逐步在臨床實施。

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（收稿日期：2017-06-12）