王濤，魯茜，高杏，李偉，呂冬梅#（.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇徐州00；.江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 004；.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇徐州00）

隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病率迅速上升，已成為重要的公眾健康問(wèn)題[1]。T2DM的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但學(xué)者普遍認(rèn)為是環(huán)境與易感基因相互作用的結(jié)果[2]。飲食控制和運(yùn)動(dòng)雖有助于維持T2DM患者的血糖水平，但T2DM患者最終仍需接受藥物治療[3]。瑞格列奈是一種廣泛用于治療T2DM的口服降糖藥物，其作用于胰島B細(xì)胞，調(diào)節(jié)腺苷三磷酸（ATP）敏感的鉀離子通道，影響鈣離子內(nèi)流，快速促進(jìn)餐后胰島素的釋放[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，瑞格列奈單藥治療T2DM的療效及相關(guān)不良反應(yīng)存在較大的個(gè)體差異，且一定程度上與基因相關(guān)的藥物吸收、分布、代謝過(guò)程，作用靶點(diǎn)以及T2DM發(fā)病通路中相關(guān)基因的突變有關(guān)[5-6]，提示T2DM相關(guān)易感基因的多態(tài)性可能會(huì)影響瑞格列奈的療效。

一氧化氮合成酶1調(diào)節(jié)蛋白（NOS1AP）又稱為一氧化氮合酶羧基末端PDZ結(jié)合配體（CAPON），通過(guò)作用于神經(jīng)一氧化氮合酶（nNOS）PDZ區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)nNOS的活性[7]。nNOS可催化生成一氧化氮，后者在調(diào)節(jié)心血管功能和葡萄糖代謝中具有重要作用，且胰島B細(xì)胞的nNOS功能紊亂與胰島素作用及分泌密切相關(guān)[8]。NOS1AP基因多態(tài)性與T2DM易感性的相關(guān)性已被證實(shí)，其中以rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)性為最強(qiáng)[9]，但目前尚未見(jiàn)NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與瑞格列奈療效相關(guān)性的報(bào)道。故本研究以我國(guó)漢族T2DM患者為對(duì)象，初步探討了NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瑞格列奈療效的影響，為以基因?yàn)閷?dǎo)向的個(gè)體化藥物治療提供遺傳藥理學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合世界衛(wèi)生組織糖尿病分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②淮海地區(qū)漢族居民；③年齡25～70歲，BMI 18.5～30.0 kg/m2；④無(wú)胰島素促泌劑使用史；⑤為細(xì)胞色素P450（CYP）2C8*3 139Arg和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1B1（OATP1B1）521TT基因型。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過(guò)胰島素治療的患者；②使用過(guò)CYP2C8、CYP3A4、OATP1B1酶激動(dòng)劑或抑制劑（如克拉霉素、吉非貝齊、環(huán)孢霉素等）的患者；③妊娠期或哺乳期婦女；④患有嚴(yán)重疾?。ㄈ缂毙孕募」Ｋ?、腦血管意外、嚴(yán)懲創(chuàng)傷和肝腎疾?。┑幕颊?。脫落標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)生不良反應(yīng)且不能耐受者；②依從性差者；③主動(dòng)退出本研究者；④缺乏療效等相關(guān)臨床資料者；⑤失訪者。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書(shū)。

選取2015年8月-2017年3月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌門(mén)診初次確診為T(mén)2DM且未接受過(guò)任何降糖治療的漢族患者100例，其中男性58例、女性42例，平均年齡為（47.84±12.15）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（25.16±3.20）kg/m2。

1.2 治療方法

所有患者在常規(guī)降壓、調(diào)脂治療的基礎(chǔ)上，加用瑞格列奈片（德國(guó)Novo Nordisk A/S公司，注冊(cè)證號(hào)：H20130023，批號(hào)：06406340D，規(guī)格：1.0 mg）1.0 mg，tid，于餐前15 min口服。所有患者均連續(xù)治療至少8周，治療期間飲食、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣保持不變。

1.3 基因型檢測(cè)與分析

采用樹(shù)脂型基因組DNA提純?cè)噭┖校ㄉ虾Ｙ惏偈⒒蚣夹g(shù)有限公司）從患者外周血白細(xì)胞中提取DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性法（PCRRFLP）、使用Applied Biosystems 2720型PCR儀（美國(guó)Thermal Cycler公司）檢測(cè)患者NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)的基因型。PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)合成（上游引物：5′-GGTGAATGTGTACAAAGGAGAAGG-3′，下游引物：5′-CAAACTGAAATGGACCACAAAGAG-3′）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括DNA模板2.5 μL，10×Buffer 2.0 μL（含MgCl210 mmol/L），dNTP 1.0 μL（10 mmol/L），上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），Easy Taq DNA聚合酶0.25 μL（5 U/μL），滅菌雙蒸水18.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BsrⅠ酶酶切，酶切反應(yīng)體系（20 μL）包括BsrⅠ內(nèi)切酶0.5 μL（10 U/μL）、Buffer 2.0 μL、PCR 產(chǎn)物 10.0 μL、滅菌雙蒸水 7.5 μL。于65℃下消化4 h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，使用Tanon-1600R型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 觀察指標(biāo)

檢測(cè)患者的糖脂代謝和胰島素相關(guān)指標(biāo)。①采用葡萄糖氧化酶法以Cobas 8000型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）測(cè)定空腹血糖（FPG）和餐后血糖（PPG）水平；采用離子交換高效液相色譜法以HLC-723 G8型全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀（日本東曹株式會(huì)社）測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。②采用電化學(xué)發(fā)光法以Cobas 6000型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）測(cè)定血漿胰島素[空腹胰島素（FINS）、餐后胰島素（PINS）]水平；采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法[11]計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR（mU·mmol/L2）＝FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。③采用比色法以Microlab 300型半自動(dòng)生化分析儀（荷蘭威圖科學(xué)公司）測(cè)定血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較及基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡均采用χ2檢驗(yàn)。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫落情況

100例T2DM患者中有1例主動(dòng)退出、1例失訪，共有98例完成了本研究。

2.2 NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)的基因型檢測(cè)結(jié)果及分布頻率

按“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得長(zhǎng)度為358 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。該產(chǎn)物經(jīng)BsrⅠ酶酶切后，共檢出AA（野生）型、AC（雜合子）型、CC（突變純合子）型3種基因型，其中AA型表現(xiàn)為152、206 bp 2個(gè)條帶，AC型表現(xiàn)為152、206、358 bp 3個(gè)條帶，CC型表現(xiàn)為358 bp 1個(gè)條帶，詳見(jiàn)圖1。98例患者中，AA、AC、CC型患者各39、42、17例，分布頻率分別為39.8%、42.9%、17.3%；A、C等位基因分布頻率分別為61.2%和38.8%。各基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

圖1 NOS1AP基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的電泳圖Fig 1 Electrophorogram of amplified products of 斜體>NOS1AP gene after enzyme digestion

2.3 治療前后T2DM患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較

98例T2DM患者接受瑞格列奈連續(xù)治療8周后，其FPG、PPG、HbA1c、HOMA-IR、TC、TG水平較治療前均顯著下降，F(xiàn)INS、PINS水平較治療前均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而治療前后患者HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 98例T2DM患者治療前后各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較（n＝98）Tab 1Comparison of clinical indexes in 98 patients with T2DM before and after treatment（n＝98）

2.4 NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瑞格列奈療效的影響

3種基因型患者的性別、年齡、BMI、腰臀比等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療前，AA、AC、CC型患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，各基因型患者FPG、PPG、HbA1c水平，AA型患者HOMA-IR水平，CC型患者TC水平，AA、CC型患者TG水平均較治療前顯著下降；各基因型患者PINS水平，AC、CC型患者FINS水平，CC型患者HOMA-IR水平均較治療前顯著升高；CC型患者FPG、PPG水平顯著高于AA、AC型患者，其較治療前的下降值顯著小于AA、AC型患者；AC型患者FPG水平顯著高于AA型；AC、CC型患者FINS水平及較治療前的上升值、HOMA-IR水平均顯著高于或大于AA型，各基因型患者HOMA-IR較治療前的變化值兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而其余指標(biāo)在治療前后、組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表2～表4。

表2 各基因型T2DM患者治療前后血糖水平比較（±s）Tab 2 Comparison of blood glucose levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment（±s）

表2 各基因型T2DM患者治療前后血糖水平比較（±s）Tab 2 Comparison of blood glucose levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment（±s）

注：與治療前比較，＊P＜0.05；與AA型比較，#P＜0.05；與AC型比較，ΔP＜0.05Note：vs.before treatment，＊P＜0.05；vs.AAgenotype，#P＜0.05；vs.AC genotype，ΔP＜0.05

HbA1c，%FPG，mmol/L基因型n PPG，mmol/L差值-2.71±1.49-2.48±1.31-2.51±2.03 0.251 0.778 AA型AC型CC型F/H P 39 42 17治療前9.99±2.39 10.45±2.22 10.10±2.01 0.986 0.611治療后6.50±1.27＊7.30±1.50＊#9.09±2.05＊#Δ 29.056＜0.001差值-3.49±2.37-3.15±2.23-1.01±0.85#Δ 20.313＜0.001治療前17.24±4.03 17.23±3.59 17.04±4.58 0.373 0.830治療后10.45±3.23＊11.34±2.85＊13.61±3.92＊#Δ 5.446 0.006差值-6.80±4.10-5.89±3.61-3.44±2.80#Δ 11.352 0.003治療前9.72±1.79 9.55±1.78 9.35±2.27 1.435 0.488治療后7.01±0.74＊7.07±1.01＊6.85±0.61＊0.432 0.650

表3 各基因型T2DM患者治療前后胰島素水平比較[M（P25，P75）]Tab 3 Comparison of insulin levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment[M（P25，P75）]

表4 各基因型T2DM患者治療前后血脂水平比較Tab 4 Comparison of blood lipid levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment

3 討論

NOS1AP基因位于染色體1q23.3，長(zhǎng)度約299 kb，編碼NOS1AP蛋白，后者與線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的nNOS結(jié)合，nNOS通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和胰島素釋放[8-9]。有研究指出，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一氧化氮合酶（NOS）受到抑制后，可造成胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，從而引發(fā)高血糖[8]。Hu C等[9]以我國(guó)漢族人群為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM易感性最為相關(guān)，該位點(diǎn)位于NOS1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域，突變類型為A/C，風(fēng)險(xiǎn)基因?yàn)镃?，F(xiàn)有文獻(xiàn)以NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與精神分裂癥的相關(guān)性研究居多，其機(jī)制可能與該位點(diǎn)突變后影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和NOS1AP基因表達(dá)相關(guān)[12]。有研究顯示，NOS1AP基因突變可影響磺脲類和格列奈類藥物的療效[9]。一項(xiàng)以上海市漢族人群為對(duì)象的研究發(fā)現(xiàn)，NOS1AP基因rs10494366位點(diǎn)堿基突變可影響瑞格列奈的療效，其中NOS1AP基因rs10494366位點(diǎn)TG和GG型患者的病死率更低[13-14]。然而，另一項(xiàng)以韓國(guó)人群為對(duì)象的研究結(jié)果則顯示，NOS1AP基因rs10494366位點(diǎn)多態(tài)性與格列美脲的療效無(wú)關(guān)[15]。目前雖未見(jiàn)NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瑞格列奈療效影響的相關(guān)報(bào)道，但NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性可直接或間接影響胰島B細(xì)胞功能或胰島素分泌[8]，而瑞格列奈可促進(jìn)胰島B細(xì)胞釋放胰島素，故探討NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與瑞格列奈療效的相關(guān)性具有一定的臨床意義。

瑞格列奈在體內(nèi)經(jīng)過(guò)OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞，通過(guò)肝臟CYP2C8和CYP3A4酶代謝為無(wú)活性的產(chǎn)物[16-17]。因此，OATP1B1、CYP3A4、CYP2C8基因突變可能會(huì)影響瑞格列奈的體內(nèi)代謝過(guò)程[17-18]。其中，OATP1B1 521T＞C位點(diǎn)的突變可抑制OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而導(dǎo)致瑞格列奈血藥濃度的升高[18]；CYP2C8*3多態(tài)性可影響瑞格列奈的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特征[17]。因此，本研究選擇了具有相同OATP1B1、CYP2C8*3基因型（野生型）的患者作為研究對(duì)象，以排除相關(guān)基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝的影響。由于CYP3A4存在多個(gè)突變位點(diǎn)，其中大部分位點(diǎn)在我國(guó)漢族人群中的突變頻率較低[19]，故本研究暫未考慮CYP3A4基因多態(tài)性的影響。

本研究結(jié)果顯示，治療后各基因型患者FPG、PPG、HbA1c水平，CC型患者TC水平，AA、CC型患者TG水平均較治療前顯著下降；各基因型患者PINS水平，AC、CC型患者FINS水平均較治療前顯著升高；CC型患者FPG、PPG水平顯著高于AA、AC型患者，其較治療前的下降值顯著小于AA、AC型患者；AC型患者FPG水平顯著高于AA型；AC、CC型患者FINS水平及較治療前的上升值均顯著高于或大于AA型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示經(jīng)瑞格列奈治療后，攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因C的T2DM患者的FPG、PPG和FINS水平顯著高于AA（野生）型患者，從一定程度上揭示了NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性與瑞格列奈療效的相關(guān)性。此外，治療后CC型患者體內(nèi)TC、TG水平也較治療前顯著下降，但各基因型患者之間血脂水平差異不大，提示NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性可能與瑞格列奈的調(diào)脂作用無(wú)關(guān)。

患者體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖水平可加重胰島素抵抗，胰島B細(xì)胞會(huì)代償性分泌大量胰島素使血糖維持在正常范圍內(nèi)，故臨床上常用HOMA-IR來(lái)評(píng)估T2DM患者的胰島素抵抗水平[11]。本研究結(jié)果顯示，AA型患者HOMA-IR水平較治療前顯著降低，CC型患者該指標(biāo)則較治療前顯著升高，且AC、CC型患者該指標(biāo)顯著高于AA型，各基因型患者HOMA-IR較治療前的變化值兩兩比較差異顯著，提示T2DM患者攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因C越多，其HOMA-IR水平越高。其中，CC型患者胰島素抵抗水平最高，其胰島素敏感性明顯下降，需要釋放更多的胰島素來(lái)維持正常的血糖水平。有動(dòng)物研究表明，敲除小鼠nNOS相關(guān)編碼基因可誘導(dǎo)其發(fā)生胰島素抵抗[20]；同時(shí)，胰島B細(xì)胞nNOS功能紊亂與胰島素抵抗及胰島素分泌有關(guān)[8，21-22]。由此推測(cè)，NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因C可影響瑞格列奈治療T2DM的療效，且可能與胰島素抵抗有關(guān)。

綜上所述，NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性可影響瑞格列奈治療我國(guó)T2DM患者的療效，NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因C可通過(guò)影響患者FPG、PPG、FINS和HOMA-IR水平來(lái)降低瑞格列奈的療效。這一結(jié)論可為該藥的臨床應(yīng)用提供一定的參考。但本研究尚存在以下不足之處：（1）僅研究了與T2DM相關(guān)性明顯的NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)，而其他與之處于連鎖不平衡中的重要單核苷酸多態(tài)性有可能被忽略；（2）考慮到患者的依從性及回訪率，入組患者連續(xù)接受瑞格列奈治療至少8周，雖在該時(shí)間段內(nèi)可觀察到相關(guān)臨床指標(biāo)的明顯變化，但觀察HbA1c下降最理想的時(shí)間是在治療后12周[23]；（3）樣本量不夠大，可能會(huì)造成一定偏倚。因此，本研究將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)一步對(duì)基因多態(tài)性與藥物相互作用的機(jī)制進(jìn)行研究，更深入地闡明降糖藥物療效的遺傳藥理學(xué)決定因素。

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