董良鵬，張景航

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 河南 新鄉(xiāng) 453100）

近100年來，乳腺癌的臨床手術方式不斷演變與革新。當今，腫瘤完整切除與乳房外形美容效果并重的理念在乳腺癌術式發(fā)展趨勢中愈發(fā)成為主流。其中，乳頭乳暈復合體（nipple-areola complex, NAC）被保留，對重建后好的乳房外形美容效果具有重要影響。作為一種全身性疾病，乳腺癌在發(fā)病早期，可通過血液發(fā)生遠處轉移[1-2]；NAC歸屬于乳腺導管系統(tǒng)，將其保留意味著在一定程度增加殘留癌的風險。行保留NAC乳房切除術（nipple-areola complex sparing mastectomy,NSM）即乳腺癌改良根治術，預知NAC受癌侵犯的概率非常必要。然而關于乳腺癌侵犯NAC的臨床檢出率相關報道有差異，2008～2014年的文獻顯示為8.9%～28.0%，平均16.7%[3-14]。有學者指出，NAC的不同病理標本獲取方式及檢查方法是影響乳腺癌侵犯NAC臨床檢出率的重要因素[12]。本研究采用兩種不同的NAC取材方法，分別經蘇木精-伊紅（hematoxylineosin, HE）染色與免疫組織化學法（簡稱免疫組化）染色（immunohistochemistry, IHC），旨在考察不同檢查方法對乳腺癌侵犯NAC臨床檢出率的影響，繼而為臨床乳腺癌患者接受NSM術治療提供可行性參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月-2016年11月在本院接受乳腺癌根治術治療的原發(fā)性乳腺癌女性患者病理標本240例，采用隨機數字表法分為觀察組與對照組，各120例。其中，觀察組病理標本所屬患者年齡28～48歲，平均（37.4±8.2）歲；參照美國癌癥聯(lián)合委員會提出的乳腺癌分期標準，Ⅰ期33例，Ⅱ期87例。對照組病理標本所屬患者年齡27～51歲，平均（38.6±9.4）歲；Ⅰ期39例，Ⅱ期81例。另同期選取已證實為乳腺癌與乳腺腺病患者各20例，將乳腺癌組織與乳腺腺病皮膚組織分別作為本研究IHC檢查的陽性與陰性對照樣本。乳腺癌病理組織標本排除標準：①明確為Paget's??；②合并NAC肉眼可見異常，如凹陷、潰瘍破損、出血溢液、濕疹樣改變、乳頭后方捫及腫塊等；③術前有接受新輔助化療治療；④初治時已發(fā)生有遠處轉移。

1.2 方法

1.2.1 取材 對照組于乳頭的正中矢狀面進行取材，取材深度5 mm；觀察組取乳頭與乳暈皮膚以及連同皮下10 mm的整塊組織，采用本院自創(chuàng)5刀法：于乳頭正中矢狀面切1刀作為首刀，再根據患者乳頭實際大小平行首刀于兩側每隔1～2 mm各切2刀，最后在乳頭根部一分為二。

1.2.2 檢查 分別經常規(guī)HE及IHC處理后鏡檢。IHC處理方法為：選擇細胞角蛋白19（cytokerantin-19,CK-19）為目標蛋白，抗體及相關試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將取得的組織標本經10%甲醛固定，再經脫水、透明、浸蠟及包埋程序處理后，4 μm連續(xù)切片，采用En Vision 2步法，將切片經烤片、脫蠟，逐級乙醇由高至低至入水，入3%過氧化氫液5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）浸3遍，5 min/遍，放入pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復：高壓鍋噴氣后，加熱2 min，改中火2 min，之后關火并持續(xù)燜10 min，結束后放至冷水中冷卻至37℃并進行1 min胃酶消化，放入PBS緩沖液洗3遍，加CK-19一抗（鼠抗人單克隆抗體），4℃冰箱孵育過夜，PBS緩沖液浸3遍，5 min/遍，加二抗PV6000（通用型抗體）37℃ 10 min，PBS緩沖液浸3遍，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇由低至高濃度逐級脫水至入二甲苯，封片。完成后由2位經驗豐富的檢驗科診斷醫(yī)師共同評估，所得結果定為最終的病理診斷結果。以鏡檢中觀察到細胞膜細胞漿內有棕黃色顆粒為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

20例已證實為乳腺癌的乳腺癌組織經IHC處理后檢查結果顯示均為陽性，20例已證實為乳腺腺病的乳腺腺病皮膚組織織經IHC處理后檢查結果顯示均為陰性。將乳腺癌侵犯NAC的檢出情況分別進行組內及組間比較，結果顯示：兩種方法處理后的檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組IHC處理后的檢出率高于HE檢出率；對照組兩種方法處理后的檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經HE處理后，兩組患者檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經IHC處理后，觀察組檢出率高于對照組（P＜0.05），見附表和圖1～ 2。

附表 兩組患者乳腺癌侵犯NAC的檢出率比較[n =120，例（%）]

圖1 NAC癌細胞侵犯 （HE ）

圖2 NAC癌細胞微侵犯 （IHC）

3 討論

在理想控制腫瘤病情的基礎上最大程度提升手術美容效果是現(xiàn)代乳腺外科的重要目標之一[15]。傳統(tǒng)乳腺癌乳房切除術通常要求先將NAC切除，乳房重建手術時一并將其重建。相關資料顯示，有36%的乳房重建患者對乳頭重建效果并不滿意，甚至由此誘發(fā)心理問題[16]。FREEMAN[17]1962年首次提出NSM術式和相關理念，但該術式對乳腺癌治療的安全性曾一度引發(fā)爭議。隨著對乳腺癌生物學特性認知的加深及其治療手段的持續(xù)進步，目前多個醫(yī)療機構通過大樣本前瞻性試驗證實NSM在長期生存率方面已愈發(fā)趨近傳統(tǒng)根治術[18]。盡管如此，關于NSM治療當前仍尚有許多問題未達成統(tǒng)一，其中每位患者是否具備有接受NSM治療的指征尤為關鍵，而開展NSM術前病例篩選的基本標準即是要求腫瘤未侵犯NAC[19]。在臨床實際工作中，NSM治療多在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者中開展，故本研究所收集的240例病例標本其患者均為Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，具有臨床代表性。

在臨床乳腺癌標本的切除處理過程中，NAC病理取材方法主要涉及取材方向、取材深度以及取材間隔和數量等因素，這些因素選擇不同的標準是導致最終獲得NAC侵犯檢出率呈差異的重要原因。就取材方向來看，主要包括依照矢狀面與冠狀面兩種方法取材，臨床采用矢狀面取材為主，而傳統(tǒng)NAC取材通常于乳頭正中矢狀面取1塊。有學者研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌侵犯NAC并非完全呈中心性特征，因此于乳頭正中矢狀面取材可造成假陰性率嚴重偏高[20]。就取材深度來看，各研究也存在較大差異，從3～20 mm不等。侵犯較輕者若取材過淺也可能導致假陰性率升高；NAC定義為乳頭與乳暈及其下方10 mm之內的乳腺組織，故取材過深，甚至達到RUSBY[4]報道的20 mm，則可能導致假陽性率升高。在其研究中，NAC侵犯率達到24.6%。在本研究納入的對照文獻中處于較高水平，不排除有假陽性樣本的可能。就取材間隔及數量來看，參考復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科所采用的取材方法：垂直于乳腺表面沿矢狀面每隔3～5 mm將NAC多切面切開，再于最大矢狀面選擇性取材1、2塊。在本研究中，筆者考慮到實際臨床操作時，為預防NAC在術后發(fā)生缺血壞死往往于基底多保留5～10 mm，這也比較符合NAC的解剖結構，故本研究在取材時選取乳頭與乳暈皮膚以及連同皮下10 mm的整塊組織更具臨床參考意義。另外采用本院自創(chuàng)5刀法，提示該取材方法通過縮小取材間隔并適當增加樣本獲取量，可實現(xiàn)更全面且多點位掌握NAC受侵犯情況，避免傳統(tǒng)取材造成的漏診或誤診；同時基于取材深度與NAC解剖結構的貼合，其結果也更具客觀性與準確性。

乳腺癌在其早期即可發(fā)生微小轉移，因此在該階段內及時發(fā)現(xiàn)這些微侵犯灶對指導臨床開展乳腺癌治療具有特殊意義。細胞角蛋白（cytokerantin, CK）是一種分布于外胚層起源細胞中的中間纖維絲，為細胞骨架的組分之一。研究認為[21]，在細胞轉化過程中CK所具有的亞微結構及免疫學特性一般不會改變，故檢測其類型有助于判斷腫瘤組織學來源。本研究所選擇的目標蛋白CK-19正常情況下在上皮性腫瘤（如乳腺癌、胃腸癌及肺癌等）組織中穩(wěn)定表達，但在外周血、淋巴結、皮膚以及NAC中不表達[22]。也就是說，在NAC中找到CK-19陽性細胞即可被認定為已經發(fā)生轉移的乳腺腫瘤細胞。自上世紀90年代以來，CK-19即被廣泛應用于包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤微轉移的檢測，并呈高敏感性與特異性。本研究20例已證實為乳腺癌的組織樣本均為陽性，20例已證實為乳腺腺病的組織樣本均為陰性，進一步驗證將CK-19作為目標蛋白的可行性。

綜上所述，本研究采用的乳頭矢狀面5刀法取材是一種更客觀更全面的取材方法。選擇CK-19為目標蛋白并行IHC處理有助于發(fā)現(xiàn)NAC的微侵犯灶，將以上取材方法及檢測方法聯(lián)合運用所獲得的乳腺癌侵犯NAC檢出率可更準確地反應乳腺癌NAC受累的真實情況，具有臨床指導意義。

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