蘇周

摘 要： 向日葵是一種非常重要的油料作物，其轉(zhuǎn)化和再生卻非常具有挑戰(zhàn)性，本文討論了向日葵的轉(zhuǎn)化和再生的幾個(gè)影響因素。

關(guān)鍵詞： 向日葵；組織培養(yǎng)；遺傳轉(zhuǎn)化

向日葵是世界上非常重要的油料作物之一，并且從轉(zhuǎn)化和再生的角度來說，它也是一種非常具有挑戰(zhàn)性的物種[1]。關(guān)于向日葵轉(zhuǎn)化和再生，國內(nèi)外都有許多嘗試，但是轉(zhuǎn)化效率都不高，并且可重復(fù)性較低[2]。向日葵的離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化，大多通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生。向日葵的轉(zhuǎn)化和再生受到許多方面的影響，本文著重討論影響向日葵轉(zhuǎn)化和再生的幾個(gè)方面。

1.向日葵的再生

1.1向日葵品系的選擇

向日葵的品種眾多，在研究的過程中，不同的研究者選擇了不同的株系，有HA300B自交系、KBSH、Ha89等一系列株系。關(guān)于不同的株系的再生和轉(zhuǎn)化，劉海學(xué)選取了RHA266， HA300， 2603， 2736和PR29等五個(gè)株系研究向日葵的轉(zhuǎn)化，其中RHA266具有最高的轉(zhuǎn)化效率[1]，除此之外，在研究不同日齡未成熟胚的分化情況時(shí)，還選取了89B1、PR29、HA300、RHA265、RHA266、JK6（品系）、JK8（品系）和龍葵雜等株系，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，89B1誘導(dǎo)分化的效率最高[3]；馬雪霞選取了936011、936012、No5B、926021× 6022、934002、956012、7961等幾個(gè)油用向日葵品系作為研究對(duì)象，其中只有956012在實(shí)驗(yàn)中的一種培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出芽，而且再生頻率非常低，僅有5%[4]。

1.2不同的外植體對(duì)向日葵再生的影響

向日葵離體再生現(xiàn)已從子葉、花藥、下胚軸、莖尖、原生質(zhì)體和未成熟胚等材料獲得成功。但是雖然這些外植體誘導(dǎo)成苗均有報(bào)道，但實(shí)際上很多材料都很難重復(fù)，即使可以重復(fù)，其分化效率都比較低。就目前研究結(jié)果來看，子葉、未成熟胚、下胚軸和莖尖這四種類型的外植體較易誘導(dǎo)分化出再生植株[2]。

1.2.1器官發(fā)生

向日葵的器官誘導(dǎo)在子葉、下胚軸、莖尖、真葉都在不同程度上誘導(dǎo)分化出成苗。其中，子葉、下胚軸和莖尖相對(duì)來說較易誘導(dǎo)出再生植株，但是誘導(dǎo)出不定芽的效率不高，僅有2.5%-12%[2]。衛(wèi)志明等人使用幼嫩子葉和下胚軸作為材料，誘導(dǎo)愈傷組織，并成功分化出芽，但下胚軸的愈傷的形成和分化明顯高于子葉[5]。并且，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，就子葉、真葉和下胚軸而言，真葉不易誘導(dǎo)出芽，子葉在靠近生長點(diǎn)附近易形成單個(gè)植株，下胚軸離生長點(diǎn)越近越容易誘導(dǎo)出芽，這幾種外植體的誘導(dǎo)分化出不定苗的能力為：子葉節(jié)>下胚軸>子葉>真葉[4]。

1.2.2胚胎發(fā)生

最近的研究中關(guān)于使用未成熟胚作為組織培養(yǎng)材料并成功獲得離體植株的報(bào)道越來越多。從1990年開始，宋英凱就對(duì)未成熟胚誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行了研究。劉海學(xué)選擇了未成熟胚中的體細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)在胚胎大小小于2mm時(shí)，在含有 0.4 mg/l 2，4-D 和 120 g/l 蔗糖的MS培養(yǎng)基上具有高轉(zhuǎn)化率（45.5%）[1]。在此之前，他也曾嘗試過萌發(fā)用未成熟胚取子葉誘導(dǎo)分化，研究表明，對(duì)授粉后的10-12天的未成熟胚誘導(dǎo)分化時(shí)的分化率最高，可高達(dá)73%，如果幼胚過小，則無法發(fā)育成苗，但若幼胚過大，種子則很容易進(jìn)入休眠[2]。

1.3不同激素對(duì)再生植株的影響

在植物的組織培養(yǎng)中，內(nèi)外源激素的比例是影響植物向日葵是一種內(nèi)源生長素較高的植物，所以添加外源細(xì)胞分裂素十分重要，只有細(xì)胞分裂素的濃度較高時(shí)，誘導(dǎo)出芽的可能性才更高[10]。對(duì)于誘導(dǎo)子葉和下胚軸分化，NAA與6-BA的組合，能夠分化成苗，IAA與KT和6-BA的組合均不可以，并且在NAA的濃度高于0.5mg時(shí)，分化率也很低[5]；而對(duì)于未成熟胚來說，6-BA與IAA的激素配比為40：1是，分化效率最高，可高達(dá)80%[4]。

2.向日葵的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域非常重要的一種研究方法之一，對(duì)于研究特定的基因的功能以及改善植物的性狀都提供了有力的技術(shù)支持。1978年，Everett等人以下胚軸為外植體，通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)首次成功地將未知外源基因轉(zhuǎn)入向日葵的基因中，并用卡那霉素篩選出陽性再生植株[6]。目前，關(guān)于向日葵的遺傳轉(zhuǎn)化主要的方法有：農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法、聚乙二醇（PEG）法等轉(zhuǎn)化方法，目前應(yīng)用較廣的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。轉(zhuǎn)化效果可通過卡那霉素篩選、GUS瞬時(shí)表達(dá)篩選、PCR、將GFP作為報(bào)告基因和southren印記的方法來鑒定陽性植株。

小結(jié)

關(guān)于向日葵的轉(zhuǎn)化和再生，雖然已有成功案例，但是其再生能力有限和轉(zhuǎn)化效率較低仍是需要攻克的難題，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和探索。

參考文獻(xiàn)

[1]Liu H X， Xie D， Sun S J， et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation of sunflower （Helianthus annuus L.） immature embryos.[J]. Australian Journal of Crop Science， 2011， 5（12）：349-376.

[2]劉海臣. 向日葵組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2011， 26（2）：190-192.

[3]劉海學(xué)， 季靜， 王萍，等. 向日葵未成熟胚組織培養(yǎng)及再生芽的研究[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2003， 18（5）：411-414.

[4] 馬雪霞， 藍(lán)海燕， 宋榮. 向日葵（Helianthus annus）的組織培養(yǎng)及芽分化研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 39（1）：23-24.

[5] 衛(wèi)志明， 許智宏. 向日葵的組織培養(yǎng)和植株再生[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 1983（5）：44.

[6] Everett N P， Robinson K E P， Mascarenhas D. Genetic Engineering of Sunflower （Helianthus Annuus L.）[J]. Nature Biotechnology， 1987， 130（2-3）：1201-1204.