葛玉鳳 安芳蘭 劉學(xué)榮 崔治亮 田波

摘要?CRISPR/Cas9[Clustered ?regular ?interspaced ?short ?palindromic ?repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9]系統(tǒng)是廣泛存在于細菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌體DNA的一種基因定點編輯技術(shù)，由于其具有快速、精準(zhǔn)、高效，易于設(shè)計，且特異性高等優(yōu)勢，得到了廣泛的應(yīng)用。概述了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，并介紹其結(jié)構(gòu)和編輯原理、在動物細胞系構(gòu)建中的應(yīng)用及展望，以便為更合理地應(yīng)用和改進該技術(shù)提供系統(tǒng)的文獻參考。

關(guān)鍵詞?CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù);動物細胞系;構(gòu)建

中圖分類號?Q789文獻標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0009-02

1?CRISPR/Cas9的基因座結(jié)構(gòu)和編輯原理

20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者Nakata在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了一系列的短的間隔序列[1]，但其功能一直未研究清楚。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列廣泛存在于細菌和古細菌基因組中，2002年將其正式命名為CRISPR。直到2008 年，CRISPR/Cas9才被證明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引導(dǎo)形成Cas蛋白復(fù)合體，從而抑制病毒的增殖[2]。2012年，由RNA介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9正式建立，并完成了在哺乳動物細胞中的基因組編輯[3-5] 。

基因編輯技術(shù)是通過基因的定點突變，以小片段的刪除及目的基因的插入等方式對基因組進行精確修飾的一種技術(shù)，是研究基因功能的重要手段?；蚓庉嫾夹g(shù)經(jīng)歷了一個長期而艱巨的研發(fā)歷程，鋅指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸內(nèi)切酶，較傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)易于操作，效率高，周期短，曾被應(yīng)用于動物和細胞的定點修飾和基因敲除，但隨著基因研究技術(shù)的發(fā)展，ZFNs技術(shù)在實際應(yīng)用中存在制備繁瑣，效能低，成本高的缺點，因此，TALEN技術(shù)應(yīng)運而生。2011年，TALEN技術(shù)成功應(yīng)用于目的基因的編輯[6-8]，該技術(shù)應(yīng)用簡單高效，細胞毒性較小，被廣泛應(yīng)用于動植物細胞、人細胞及斑馬魚等模式生物的研究中，但該技術(shù)的靶點模塊建立較復(fù)雜，耗時較長。截至2013年，Cong和Mali將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于人類和小鼠基因組編輯，第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)- CRISPR/Cas9技術(shù)誕生，并迅速成為各國學(xué)者研究的重點基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種模式動物模型和細胞系的建立。

CRISPR/Cas9是存在于大多數(shù)細菌和古生菌中的一種獲得性免疫系統(tǒng)。由多個重復(fù)序列和非重復(fù)的間隔序列組成，主要包括R-S結(jié)構(gòu)和編碼cas的基因操作子。R-S結(jié)構(gòu)具有特異性識別外源DNA的功能，cas基因家族可編碼多功能的CRISPR蛋白，并與成熟的crRNA共同作用[9]構(gòu)建抵御外來病毒入侵的免疫屏障。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中cas蛋白的不同，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 種類型。I型和III型CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要多個Cas蛋白的參與，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需要Cas9蛋白即可對DNA特定位點進行修飾，是目前研究的最徹底，也是應(yīng)用最為廣泛的。其作用機制主要通過三個階段實現(xiàn)：獲得CRISPR可變間隔序列、轉(zhuǎn)錄crRNA前體與加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9復(fù)合體剪輯外源性DNA[10]。與傳統(tǒng)的ZFN、TALEN基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過設(shè)計不同的RNA向?qū)蜻M行定點修飾，操作簡單易行，高效，基因修飾可遺傳，無物種限制，實驗周期較短，成本較低，對細胞毒性較小，適合于多基因、高通量的操作，可應(yīng)用在各種不同的細胞和模式生物中，且發(fā)生同源重組的概率比自然發(fā)生同源重組的概率高。

2?CRISPR/Cas9技術(shù)在動物細胞系構(gòu)建中的應(yīng)用

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究深入和不斷完善，該技術(shù)已成為動植物基因功能研究、建立細胞系和疾病模型的主要手段，尤其在動物細胞系的建立方面起到了重要的作用，目前，該技術(shù)在動物細胞系建立中的應(yīng)用主要包括基因敲除、基因插入和基因修飾3個方面。

2.1?基因敲除

我國科學(xué)家針對豬的酪氨酸酶、PARK2 和PINK1 基因的外顯子設(shè)計了Cas9 打靶質(zhì)粒，獲得了純合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2 和PINK1 雙基因敲除的細胞系，該細胞系用于體細胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除豬和PARK2 和PINK1 雙基因敲除豬，建立了人類白化病和帕金森綜合征2種豬模型，該研究團隊首次將CRISPR/Cas9技術(shù)與體細胞克隆相結(jié)合，實現(xiàn)了大型家禽雙基因的等位敲除，這對于人類遺傳性疾病的研究有重大意義[11]。近期，又有中國學(xué)者通過CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了酪氨酸酶（TYR）等位基因突變的豬胎兒成纖維細胞系和PARK2 和PINK1雙基因knock-out 的細胞系，成功培養(yǎng)出基因突變的個體，并可穩(wěn)定遺傳給下一代。韓秋影等[12]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)實現(xiàn)了細胞水平的基因敲除技術(shù)，同時構(gòu)建了能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HEK293細胞，并運用CRISPR/Cas9基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù)，使得HEK293 細胞cGAS基因的轉(zhuǎn)錄激活。MEIS2（一種高度保守的同源盒轉(zhuǎn)錄因子）可廣泛調(diào)控胚胎的早期發(fā)育和腫瘤的發(fā)生，研究者[13]通過設(shè)計2個靶向sgRNA，介導(dǎo)外源Cas9蛋白與基因特異性位點結(jié)合，構(gòu)建了可穩(wěn)定敲除MEIS2基因的HEK293T細胞株。

2.2?基因敲入

傳統(tǒng)的基因定點敲入是通過同源重組的方式將目的基因整合到細胞基因組中，篩選產(chǎn)量較高的單克隆，但此方法無法精確控制基因的插入位點，因此整合效率較低。CRISPR/Cas9 技術(shù)為構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)的重組細胞提供了可行性。有研究發(fā)現(xiàn)CTCF（脊椎動物關(guān)鍵的絕緣子蛋白）對動物細胞基因表達調(diào)控起著重要的作用，其缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎死亡。通過CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，將MD（有絲分裂期特異性降解結(jié)構(gòu)域）敲入CTCF表達框上游，從而帶動CTCF蛋白周期性持續(xù)降解，獲得了CTCF蛋白特異性降解細胞系[14]，體現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)對基因組改造的簡易性和特異性。段宇紅[15]等將4種不同的表達PCV2（豬圓環(huán)病毒）功能蛋白基因定點插入到PK15細胞的Rosa26位點，從而建立了穩(wěn)定的可表達PCV2的細胞系，為研究PCV2病毒在哺乳動物細胞中復(fù)制水平低的機制奠定了基礎(chǔ)。

2.3?基因修飾

WHO統(tǒng)計結(jié)果顯示，目前世界上有近6 000多種疾病與基因發(fā)生異常相關(guān)，但在臨床上仍缺乏有效的治療體系，由于干細胞具有較強的可塑性和重建能力，因此干細胞基因修飾技術(shù)成為構(gòu)建疾病模型、篩選靶向藥物和制備治療型干細胞的關(guān)鍵技術(shù)，也成為了人類基因疾病治療的新希望。王曄博[16]等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯原理，在人的多功能干細胞WAN基因第6個內(nèi)含子的高突變位點區(qū)域，設(shè)計了2個gRNAs，通過IDLV攜帶模板序列的方法篩選出了同源重組子，其正確率達50%，有效優(yōu)化了人多功能干細胞中基因編輯效率，為研究發(fā)育生物學(xué)和某些疾病的機理提供了操作平臺。有學(xué)者[17]利用Cas9核酸酶在sgRNA 介導(dǎo)下可引起基因組DNA雙鏈斷裂，從而形成同源重組修復(fù)的特性，構(gòu)建了綠色熒光標(biāo)記的CD34報告基因293AD細胞系，為后續(xù)人體細胞誘導(dǎo)去分化成造血干細胞提供了有利的工具。韓笑等[18]利用gRNA定位，引導(dǎo)Cas9蛋白精確定位進行DNA剪切，并啟動DNA自我修復(fù)機制，建立了能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的小鼠胚胎干細胞系，實現(xiàn)了多個位點的同時編輯，同時運用Cas9核酸酶在DNA雙鏈上精確剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脫靶率，有效提高了應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在胚胎干細胞中進行基因編輯的效率。

因此，高效的基因編輯技術(shù)和精確的基因操作方法為構(gòu)建所需的細胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)作為近幾年興起的第三代基因編輯技術(shù)，日漸廣泛應(yīng)用于病毒基因組的編輯、細胞系的建立及人類疾病模型的研究等各領(lǐng)域，提供了一種簡單高效的基因重組的篩選方法，極大地推動了基因工程技術(shù)的應(yīng)用研究。

3?展望

CRISPR/Cas9 技術(shù)已開發(fā)為具有多功能的技術(shù)，但在長期的研究應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 技術(shù)在動植物細胞基因改造及其他應(yīng)用方面存在著脫靶的風(fēng)險。而且在基因編輯過程中，CRISPR/Cas9產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的同時可能激活p53蛋白通路，從而導(dǎo)致基因編輯失敗，在臨床治療中產(chǎn)生風(fēng)險。因此，結(jié)合以上對CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和編輯原理、在動物細胞系建立中的應(yīng)用及存在的問題等現(xiàn)狀的分析，可進一步完善CRISPR/Cas9系統(tǒng)在干細胞中的同源修飾效率、在干細胞中對遺傳性P-globing異常疾病的基因治療及p53基因功能監(jiān)控等方面的研究，最終為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病研發(fā)、精準(zhǔn)醫(yī)療和個體化醫(yī)療提供服務(wù)。

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