楊林，王磊, 胥彤，何俊杰

蘭州理工大學 生命科學及工程學院,甘肅 蘭州 730050

1.緒論

甘草是中國2000多種草藥中用量最大的一種傳統中藥材，具有調和諸藥、益氣補脾、祛痰止咳、清熱解毒、預防癌癥等功效，素有“十方九草，無草不成方”之說[1]。烏拉爾甘草具有明顯抗病毒[2]、抗炎[3]、抗菌及抗血栓[4]等作用。本實驗旨在研究甘草根內生真菌分離鑒定及其代謝產物抑菌活性研究，篩選出甘草抑菌活性內生真菌，為甘草資源綜合開發(fā)利用奠定基礎。

1.1 甘草藥理作用研究現狀

（一）抗菌與抗病毒活性：甘草多年臨床應用于病毒性呼吸系統疾病、肝炎、呼吸系統感染、口腔潰瘍等多種細菌或病毒性疾病，提示甘草可能具有良好的抗菌和抗病毒作用?，F代試驗表明，甘草的水提取部位、甲醇提取部位、超臨界提取物都具有一定的抗菌活性，對多種革蘭陰性菌、革蘭氏陽性菌均表現出一定的抑制作用[5]。

（二）抗炎作用：甘草具有皮質激素樣抗炎作用。甘草水煎劑能抑制被動皮膚過敏反應，降低小鼠血清IgE抗體水平，但對SRBC致IgG抗體的產生無影響[6]。

（三）抗病毒作用：甘草甜素對人體免疫性缺陷病毒(HIV，艾滋病毒)，肝炎病毒及水痘，帶狀皰病毒等的增殖有抑制作用[6]。

（四）抗癌活性：甘草提取物可直接有效抑制乳腺癌、歐利希腫瘤、埃列希腹水腫瘤、子宮內膜癌及多種實體瘤的生長和細胞增殖，同時還能有效抑制肺癌的轉移[5]。

1.2 內生真菌生物活性研究進展

近些年，植物內生真菌所產生的代謝產物在生物醫(yī)學方面研究成為熱點，內生真菌作為一種潛力巨大的微生物資源，從其代謝產物中篩選尋找有價值的先導化合物已成為新藥研發(fā)的重要途徑和來源。國內外研究發(fā)現，植物內生真菌能夠產生抗生素類、抗氧化類、抗腫瘤類[7]等其他活性物質。

2.材料與方法

2.1 植物材料

烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)，于2015年11月購于甘肅民勤，由蘭州理工大學生命學院楊林副教授鑒定。

2.2 甘草內生真菌的分離及鑒定

將烏拉爾甘草的根沖洗干凈,用75%的乙醇泡12min,用無菌水沖洗三次，再用3%的NaClO浸泡15min，用無菌手術刀在超凈工作臺將其切成1cm的小段，將其放置于PDA培養(yǎng)基表面，在27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d,定期觀察,當切口處長出菌落時及時將菌落挑入新的PDA培養(yǎng)基中純化[8]。將真菌接種到平板上，插上滅菌的蓋玻片，生長完全后放于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察菌落、菌絲體、孢子形態(tài)。根據《真菌鑒定手冊》 初步鑒定。

2.3 次級代謝產物的制備

將分離得到的內生真菌接種于PD培養(yǎng)基中，在27℃ 120r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)10d，將得到的發(fā)酵液抽濾，將菌絲體放入干燥箱中烘干備用，菌液分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，將有機層的萃取物收集并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮備用；將干燥的菌絲體用研缽研磨均勻后用30倍體積的甲醇回流提取3次，每次1h，過濾，合并甲醇提取液，用旋轉蒸發(fā)儀將其濃縮備用，將乙酸乙酯、正丁醇、甲醇三種部位的樣品放入50℃條件下干燥至恒重[9]。

2.4 抑菌活性測定[10]

采用濾紙片法測定各樣品抑菌活性，將5種指示菌（金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，綠膿桿菌、大腸桿菌、地衣芽孢桿菌）在37℃恒溫培養(yǎng)24h，活化后用無菌水配置成菌懸液，調節(jié)菌體濃度至106CFU/mL,吸取1mL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，取直徑為6mm的無菌濾紙片，在無菌條件下用鑷子放置于上述已涂布的平板上，每皿3片，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，然后用微量移液器吸取備好的各測試樣品溶液（以甲醇稀釋至10mg/mL）15μL分別滴加于紙片上，以溶劑甲醇為陰性對照，以100U/mL的硫酸鏈霉素或青霉素鈉為陽性對照，每個樣品設三個平行。加樣后于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測定各樣品抑菌圈大小。

最小抑菌濃度（MIC）的測定，選擇對樣品溶解度好且無抑菌作用的甲醇作為溶媒，采用二倍稀釋法將樣品制為10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.313mg/mL系列濃度溶液，用濾紙片法測定抑菌圈直徑，以本實驗組中出現抑菌圈的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

3.結果與分析

3.1 甘草內生真菌分離及鑒定結果

本實驗從甘草根分離得到15株內生真菌，通過形態(tài)及顯微鑒定（菌落形態(tài)、邊緣、基質顏色、菌絲形態(tài)）共鑒定8株內生真菌，分5個屬，其中菌株R101為毛霉屬（Mucor）、菌株R102、R108、R113為鐮刀菌屬（Fusarium）、菌株R105、R09為曲霉屬（Aspergillus）、菌株R106為青霉屬（Penicillium）、菌株R107為木霉屬（Trichoderma）。

3.2 內生真菌代謝產物抑菌活性結果

抑菌實驗結果表明：甘草內生真菌發(fā)酵產物對各指示菌均有不同的抑制效果，其中對金黃色葡萄球菌表現出抑菌活性的樣品占總數46.7%；對綠膿桿菌表現出抑菌活性的樣品占總數42.2%；對肺炎克雷伯菌表現出抑菌活性的樣品占總數40%；對大腸桿菌表現出抑菌活性的樣品占總數44.4%；對地衣芽孢桿菌表現出抑菌活性的樣品占總數28.9%。

活性樣品最小抑菌濃度測定結果見表1，樣品R108(NBE)、R108(MME)、R109(EAE)、R109(NBE)、R109(MME)對綠膿桿菌具有較強的抑菌活性，其中R108（NBE）、R108（MME）、R109(EAE)的最小抑菌濃度分別為0.625mg/mL、0.312mg/mL、1.25mg/mL；R109（NBE）和R109（MME）最小抑菌濃度為2.5mg/mL。

表1最小抑菌濃度測定結果

4.結論

本研究從甘草根分離得到15株內生真菌，形態(tài)及顯微鑒定8株，初步判斷為毛霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬，其中鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌屬。帖衛(wèi)芳等[11]從甘草根分離內生真菌，并對優(yōu)勢菌落進行鑒定，確定優(yōu)勢菌落分別為鐮刀菌屬和赤霉菌屬。采用濾紙片法測定甘草內生真菌次級代謝產物抑菌活性，結果表明，次級代謝產物3個部位45個樣品中有43個樣品表現出抑菌活性，占樣品總數95.6%。甘草內生真菌具有作為發(fā)酵菌株生產活性成分原料的潛力，具有潛在的藥用價值。