王溪橋 尤 佳 王軍平 文朝慧 滿 岳

（甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010）

實蠅，昆蟲綱、雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae昆蟲的通稱，英文名稱fuit fly。全世界已知實蠅約500個屬，4500多種，中國約存在400多種。實蠅體形中小，圓球形頭部，中胸部發(fā)達，雙翅具斑。實蠅是植食性昆蟲，為害植物的根、莖、葉、花乃至果實。其中，35%的種類（約1500種）可能為害各種果，對農(nóng)業(yè)有重要經(jīng)濟意義的實蠅種類超過100種，還有150多種是次要的或潛在的害蟲。這些為害水果和蔬菜實蠅大部分屬于寡鬃實蠅屬Dacus、果實蠅屬Bactrocera、小條實蠅屬Ceratitis、繞實蠅屬Rhagoletis和按實蠅屬Anastrepha等。其中，具明顯重要性的種類，如地中海實蠅、桔小實蠅、昆士蘭實蠅、棗實蠅都是著名的有害實蠅種，這些種類在世界各國均屬檢疫對象。中國已發(fā)現(xiàn)若干種類為害柑橘、芒果、青棗、楊桃、棗、番石榴、梨、瓜等果蔬的重要害蟲，例如桔小實蠅、柑橘大實蠅、蜜柑大實蠅、南瓜實蠅、棗實蠅、番石柳實蠅、瓜實蠅、棗實蠅、枸杞實蠅等[1]。具條實蠅Bactrocera scutellata和南瓜實蠅Bactrocera tau均隸屬于雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae果實蠅屬Bactrocera，該屬昆蟲主要分布于亞洲熱帶、亞熱帶和暖溫帶以及澳大利亞和南太平洋地區(qū)，少數(shù)種類分布于非洲南部和夏威夷群島[2]。對實蠅類害蟲進行積極防控和嚴格檢疫，防止其侵入我國，對保障國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有重大意義。

傳統(tǒng)形態(tài)鑒定只能針對成蟲，對成蟲蟲體的完整性要求較高，需要有較豐富的分類經(jīng)驗和技能的鑒定人員完成。此外，近似種之間的外部形態(tài)特征區(qū)別微小，部分形態(tài)非常相似，這也給傳統(tǒng)形態(tài)分類增加了難度。近年來，隨著分子生物學技術(shù)技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子水平的檢測手段被廣泛應(yīng)用于實蠅的種類鑒定，如AFLP、RFLP以及DNA測序等[3]。DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。受零售業(yè)中被作為產(chǎn)品通用代碼的商品條形碼的啟發(fā)，加拿大Guelph 大學的分類學家Paul Hebert在2003年首次提出DNA 條形碼概念, 即利用線粒體細胞色素C氧化酶亞單位I（COI）的特定基因序列區(qū)域來做DNA 條形編碼的基礎(chǔ)，用于物種鑒定[4]。通過分析COI基因及其來源基因組核苷酸含量之間的關(guān)系，結(jié)果表明800余個COI基因5 端的DNA條形碼序列準確地代表了其來源完整線粒體的基因信息，證明對于未測序的基因組，從DNA 條形碼序列可以快速檢測并預(yù)測其完整基因組的組成。目前，隨著DNA條形碼技術(shù)的迅速發(fā)展，全球分類學家認識到分子手段檢測鑒定物種的重要性，對Genbank數(shù)據(jù)庫中COI基因序列的條目的貢獻不斷增加，使DNA條形碼鑒定技術(shù)的優(yōu)勢愈發(fā)凸顯，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，操作簡便，準確度高，檢測樣本范圍擴大，即使樣本部分受損，僅用少量生物樣本即可檢測鑒定，也不會影響識別結(jié)果[5-14]。

我國對果實蠅屬的條形碼研究也取得了一定進展，梁亮等（2011）對中國果實蠅屬25種的155條COⅠ基因序列進行了遺傳距離分析和構(gòu)建發(fā)育樹，最終得出，COI基因條碼序列能對除桔小實蠅復(fù)合體外的部分中國果實蠅屬種類能進行準確鑒定[15]。劉慎思等（2012）針對桔小實蠅桔小實蠅 B.dorsalis 的卵、幼蟲、蛹以及成蟲的殘缺肢體樣本，利用DNA條形碼技術(shù)，建立了利用DNA條形碼技術(shù)的實蠅類害蟲快速鑒定技術(shù)體系，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)完全可以用于口岸截獲的實蠅幼體及殘體的準確鑒定[16]。李靜等（2014）利用COI基因片段，對入境旅客非法攜帶的實蠅幼蟲進行了序列測定，并對培養(yǎng)出的成蟲進行了形態(tài)鑒定，最終確定了實蠅種類，為檢疫部門的DNA條碼技術(shù)在實蠅鑒定中的應(yīng)用提供了重要依據(jù)[17]。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

供試具條實蠅Bactrocera scutellata (Hendel)、南瓜實蠅Bactrocera tau標本由甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心外繁種子實驗室采集，標本浸入100%無水乙醇中-20℃條件下保存。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)鑒定

依據(jù)吳佳教等[1]資料，測量并綜合分析各實蠅形態(tài)特征，采用LEICA M205A體式顯微鏡及LEICA DMC4500顯微成像系統(tǒng)拍攝整體和局部形態(tài)特征進行鑒定。

1.2.2 DNA提取

實蠅標本的DNA提取使用TaKaRa公司MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒。剪取實蠅標本25mg肢體，參照試劑盒說明書進行DNA提取。以ddH2O為空白對照，使用試劑盒進行提取操作。使用Eppendorf BioSpectrometer微量核酸蛋白檢測儀對提取得到DNA進行檢測。

1.2.3 樣本DNA的PCR擴增及測序

1.2.3.1 PCR擴增

參考Folmer所使用的PCR擴增引物[18]，使用通用引物進行DNA擴增，引物序列LCO1490，5'-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3';HCO21985'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。由寶生物（TAKARA）公司委托合成。PCR反應(yīng)使用TAKARA公司Premix Taq（R004A）試劑盒，反應(yīng)擴增體系為 25.0μl， 包 含 premix taq12.5μl、20μmol/L 上、 下 游引 物 各 1.0μl、 模 板 DNA2.0μl、ddH2O8.5μl。PCR 儀使 用Eppendorf Mastercycler nexus,反 應(yīng) 程 序：94℃預(yù) 變 性 3min；94℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。COI基因PCR擴增粗產(chǎn)物大小應(yīng)為為685bp。PCR產(chǎn)物4℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，DNAmarker使用TAKARA公司DL1000DNAmarker。

1.2.3.2 PCR產(chǎn)物測序及基因序列比對分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確證后，送蘇州金唯智公司進行PCR產(chǎn)物純化及測序。將得到的DNA序 列 在 NCBI（ 網(wǎng) 址 https∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 及BOLDsystem（網(wǎng)址 http∶//www.boldsystems.org）在線數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

2.1.1 具條實蠅 B.（Zeugodacus）scutellata

形態(tài)特征：成蟲黑色與黃色相間。頭部中顏板具一對黑色大顏面斑，呈卵圓形。上側(cè)額鬃1對，下側(cè)額鬃3對；具內(nèi)頂鬃、外頂鬃和頰鬃；單眼鬃細小或缺如。中胸背板黑色，縫后側(cè)黃色條終于翅內(nèi)鬃著生處或其之后處，縫后中黃色條梭形或線形；肩胛和背側(cè)板胛黃色，橫縫兩側(cè)具黃色斑伸向中部；前翅上鬃、小盾前鬃和翅內(nèi)鬃存在，背中鬃缺如。小盾片較扁平，黃色，具黑色端斑，此斑大并伸越到兩小盾端鬃之外，小盾鬃1對。后小盾片和中背片全為黑色。翅前緣帶黑色，翅端擴展成斑；dm-cu橫脈覆蓋褐色斑，該斑伸達翅后緣，前端可能不連續(xù)；臀條寬；bm室長是寬的2倍；cup室后端角延伸段長，其長度超過A1+CuA2脈段長。足淡黃色，各足腿節(jié)不具暗色斑，后足脛節(jié)基部1/3黑褐色。第2～4節(jié)腹背板黑色，基橫帶寬，但第4和第5腹背板的基橫帶中部有時分離；第3～5節(jié)腹背板具黑褐色中縱帶，該縱帶有時在各節(jié)的端部處中斷；第5腹背板具橢圓形腺斑。（圖1、2）

圖1 具條實蠅背面

圖2 具條實蠅側(cè)面

2.1.2 南瓜實蠅 B.（Zeugodacus）tau

形態(tài)特征：成蟲黑色與黃色相間。頭部顏面黃色；顏面斑黑色，中等大，近卵形。上側(cè)額鬃1對，下側(cè)額鬃2對或3對或以上；具內(nèi)頂鬃、外頂鬃和頰鬃；單眼鬃細小或缺如。觸角顯長于顏面長。中胸背板黑色帶橙色或紅褐色區(qū)；介于縫后中黃色條和側(cè)黃色條之間的大部分區(qū)域、肩胛后至橫縫間的2大斑、背板中部前緣至黃色中縱條前端的狹縱紋均為黑色；肩胛、背側(cè)胛、縫前1對小斑均為黃色；縫后側(cè)黃色條終止于翅內(nèi)鬃著生處或其后之處，縫后中黃色條淚珠狀；前翅上鬃、小盾前鬃和翅內(nèi)鬃存在、背中鬃缺如。小盾片黃色，具黑色基橫帶，小盾鬃2對。后小盾片和中背片中部均為淺黃色或褐橙色，兩側(cè)帶暗色斑。翅斑褐色，前緣帶于翅端擴成1橢圓形斑，該斑約占據(jù)R4+5室寬度的1/3；dm-cu和r-m橫脈上均無橫帶；臀條寬闊，伸達后緣；A1+CuA2脈段長。足淡黃色，前足、中足和后足腿節(jié)暗色斑段占其各自腿節(jié)長的比例約為0%～30%。第2和第3腹背板的前部各具1黑色橫帶；第4和第5腹背板的前側(cè)部常具黑色短帶；黑色中縱條自第3腹背板的前緣伸達第5腹板后緣，第5腹背板具腺斑。（圖3、4）

圖3 南瓜實蠅背面

圖4 南瓜實蠅側(cè)面

經(jīng)形態(tài)鑒定，2種實蠅的形態(tài)特征與資料中具條實蠅B.（Zeugodacus）scutellata 和南瓜實蠅 B.（Zeugodacus）tau一致。

2.2 DNA提取結(jié)果

根據(jù)試劑盒說明書提取得到DNA溶液經(jīng)檢測，具條實蠅DNA溶液濃度為35.3μg/ml，A260/280=1.93；南瓜實蠅DNA濃度為29.6μg/ml，A260/A280=1.75。故所得實蠅標本DNA濃度及純度質(zhì)量較高，可以進行下一步PCR反應(yīng)。

圖5 實蠅標本各樣品PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.3 PCR擴增結(jié)果

以本研究中2種實蠅標本所提取的樣品DNA為模版進行的PCR擴增反應(yīng)，擴增所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳。檢測結(jié)果如圖5所示，M泳道為DNAmarker（TAKARA，DL1000）1-4泳道在 685bp處有清晰條帶。其中1、2泳道為具條實蠅標本樣品，3、4泳道為南瓜實蠅標本樣品，5、6泳道為空白對照。

2.4 PCR產(chǎn)物測序及基因序列比對分析結(jié)果

將2種實蠅樣品DNA擴增產(chǎn)物測序獲得的線粒體COI基因序列，在NCBI及BOLDsystem數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，具條實蠅樣品的COI基因序列同NCBI及BOLDsystem數(shù)據(jù)庫中具條實蠅標準序列的相似度最高分別為99%（GENEBANK登錄號KJ753946.1）、99.53%；南瓜實蠅樣品的COI基因序列相似度最高分別為99%（GENEBANK登錄號KJ753947.1）、99.85%。2種數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果中，相似度最高的前20個已公開COI標準序列均為目標物種序列。結(jié)果表明，實驗用樣品擴增其COI基因序列,通過序列比對，可以證實為具條實蠅及南瓜實蠅。

3 結(jié)論與討論

本研究通過傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法，輔助以DNA條形碼技術(shù)，對2種常見有害實蠅進行了鑒定研究。實驗結(jié)果表明，傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定結(jié)果同DNA條形碼分子鑒定結(jié)果一致，可以相互印證，對2種實蠅成功進行了鑒定。

植物檢疫實驗室對實蠅類害蟲的鑒定，不僅需要依靠檢疫人員具有豐富的經(jīng)驗積累，也完全依賴對實蠅蟲體完整性的依賴。隨著分子生物學檢測鑒定方法的發(fā)展，利用DNA 條形碼技術(shù)建立的物種鑒定方法已廣泛應(yīng)用于實蠅及各類有害生物的檢疫鑒定。本試驗在形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，采用分子生物學方法，僅使用25mg蟲體材料，既能對樣品進行比對鑒定，是實蠅鑒定傳統(tǒng)形態(tài)學方法的良好補充和輔助。從DNA提取、PCR擴增到測序比對得到結(jié)果，僅需要3d，大大提高了植物檢疫實驗室檢疫鑒定的周期。特別是利用DNA條形碼技術(shù)，使用少量樣品材料未來可以對無法形態(tài)學鑒定的幼蟲、蛹及昆蟲殘體等進行初步鑒定，為植物檢疫人員提供了新的檢疫鑒定手段。

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